实验七聚合酶链式反应pcr技术

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1、实验七聚合酶链式反应（PCR）技术1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果与讨论实验目的掌握PCR反应的原理及技术。实验原理聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

2、PCR：变性－退火－延伸PCR(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)反应分为三步：1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个

3、循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.PCR仪2.台式离心机3.微量取液器（二）材料模板DNA（三）试剂1.10xPCRbuffer2.dNTPs2.5mM3.Taq酶5u/μl4.引物1和2(2μmol/L)(T3,T7)5.模板实验步骤1.在0.2mlEppendorf管内配制50μl反应体系ddH2O：

4、33.5ul10xPCRbuffer：5uldNTPs（2.5mM）：4ul引物1(2uM)：1ul引物2(2uM)：1ulMgCl23ulTaq酶：0.5ul模板：2ul共50ul体系2.按下述循环程序进行扩增94℃5分钟，1个循环；94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。4℃保温。3.扩增结束后取50μl扩增产物，利用琼脂糖电泳检测DNA扩增情况,并切胶用于回收.实验结果与讨论PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。如退火温度过低，也可能出现杂带。123456789101

5、11213MPCR引物设计长度：互补序列大于20，没有上限。两引物具有较好的协调性；内部二级结构较少；加酶切位点时需要注意保护碱基长度；检测特异性；大引物与定点突变。3‘端绝对不能互补；制品说明本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。使用本试剂盒每次可纯化得到多至10mg的DNA片段（100bp～30kbp)，回收率高达50～80％。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测

6、序等各种分子生物学实验。每次处理的胶块量约为300mg时，本试剂盒可使用50次。运输、保存温度室温。DR-IIBuffer若出现沉淀，请于70℃保温溶解，待恢复至室温后使用。