外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用

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1、外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用【摘要】目的：探讨外源性结缔组织生长因子（CTGF）在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用.方法：将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为三组：对照组；CTGF小剂量组（终浓度为2.5μg/L）；CTGF大剂量组（终浓度为20μg/L）.用倒置显微镜观察细胞形态学变化；噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性；RTPCR检测HK2细胞E钙黏蛋白（Ecadherin），α平滑肌肌动蛋白（αSMA），纤连蛋白（FN）和胶原ⅠαmRNA水平

2、的变化；免疫组织化学方法观察HK2细胞FN和胶原Ⅰ的表达.结果：CTGF刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形，同时促进HK2细胞增殖.不同浓度的CTGF作用于HK2细胞48h后，αSMA和FNmRNA水平显著升高（P<0.05），E钙黏蛋白mRNA的表达显著下降（P<0.05）；大剂量CTGF刺激HK2细胞48h后胶原ⅠαmRNA水平显著升高（P<0.05）.小剂量CTGF组HK2细胞胞质FN表达水平显著增加（P<0.05），大剂量CTGF组HK2细胞胞质表达FN和胶原Ⅰ均显著增加（P&l

3、t;0.05）.结论：CTGF在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化，并促进FN的合成，大剂量的CTGF可以增加其胶原Ⅰ的合成.【关键词】结缔组织生长因子；肾小管；上皮细胞；转分化；细胞外基质　　大量证据表明，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelialmyofibroblasttransdifferentiation,EMT）是肾间质纤维化发生机制之一［1］.结缔组织生长因子（connectivetissuegroega）,Taq酶，DNAmaker(TaKaRa),羊抗人胶原ⅠαpAb（1∶200，

4、SantaCruz）,小鼠抗人FNmAb（1∶200，NeoMarkers），HRP标记兔抗羊二抗，HRP标记兔抗小鼠二抗，（1∶200），DAB显色液（武汉博士德公司）；MTT（美国Sigma公司）；图像分析处理系统（美国UVP公司）；聚合酶链反应引物：均由Invitrogen公司合成(表1).表1引物序列（略）　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及分组将HK2细胞用含100mL/LFBS的DMEM/F12培养液传代培养，培养条件为37℃，50mL/LCO2.0.5g/L胰酶＋0.2g/LEDTA消化细胞后，1

5、×108/L细胞接种于50mL塑料培养瓶.先以100mL/LFBSDMEM/F12培养细胞，70%～80％融合时改用无血清培养基培养24h，使细胞生长同步化.弃去培养液，将HK2细胞分为三组.对照组：加无血清DMEM/F12培养液；小剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为2.5μg/L）；大剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为20μg/L）.每组设3个复瓶，作用48h后收集细胞.　　1.2.2HK2细胞形态学观察加入各组试剂后，每6h在倒置显微镜

6、下观察细胞形态变化，48h后倒置显微镜下照相.　　1.2.3MTT法将HK2细胞制成悬液，按1×108/L接种于96孔板中，细胞分组同前，每组设6个复孔，刺激48h后MTT比色法测定细胞增殖，以每孔A490nm处吸光度（A）值表示.　　1.2.4RTPCR加入CTGF48h后，按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总的RNA，经紫外分光光度计鉴定，取总RNA2μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行.取1μL逆转录产物为模板，进行PCR扩增反应.GAPDH反应参数如下：预变性94℃5min,变性94℃30s

7、，退火54℃.E钙黏蛋白（Ecadherin）和纤连蛋白（fibronectin，FN）退火59℃，αSMA和胶原Ⅰα退火63℃,40s，延伸72℃30s，28个循环（Ecadherin，FN，αSMA和胶原Ⅰα32个循环）后，72℃延伸7min.取PCR产物5μL在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像后，用图像分析处理系统进行灰度扫描，以密度代表其表达量.用GAPDH量校正，计算出Ecadherin，αSMA，FN和胶原Ⅰα的相对表达量［3］.重复3次独立的RTPCR全过程.　　1.2.

8、5免疫组织化学细胞爬片制作：将HK2细胞制成悬液，按1×108/L接种于置有波片的6孔板中，培养条件、细胞分组和处理方法同前，48h后收集波片.免疫组化染色：波片冰丙酮固定,TritonX100孵育，0.3mL/L双氧水孵育，兔血清37℃封闭，加一抗，二抗，SABC液孵育，最后DAB显色，苏木素复染，PBS代替一抗做阴性对照.结果判定：以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞