骨髓基质干细胞成骨的研究进展

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1、骨髓基质干细胞成骨的研究进展组织工程技术是目前解决大块骨与软骨组织缺损修复难题最有前景的手段之一，种子细胞是组织工程学中的重要环节。骨髓基质干细胞(bonemarroalcells，BMSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，在体内外适当的诱导环境下可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种组织细胞。该细胞群来源充足，取材方便，增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能，并且异体移植免疫排斥反应小，目前已成为应用较广泛的重要种子细胞之一。本文就骨髓基质干细胞成骨问题进行阐

2、述。　　1骨髓基质干细胞的来源与获取　　骨髓基质干细胞可来源于机体各个部位骨髓。人通常取自髂骨，兔取自股骨髁上。对人而言，不同部位来源的BMSCs功能状态不一。椎骨来源的BMSCs碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性低于股骨来源的BMSCs，而骨钙素mRNA的水平较后者高。BMSCs的数量随着年龄的增长也不断减少，鼠在21个月时股骨干骨髓中的细胞要少于4个月时的骨髓细胞。BMSCs在骨髓中含量极少(1×105个单核细胞中含有1个BMSCs)，因此要求在体外培养扩增后

3、，才能达到组织工程学所要求的细胞数目。在抽取骨髓血的过程中，每一个部位抽出量不应超过2mL，否则将因抽出物中血量增加而引起有核细胞数的明显下降。　　常用获得BMSCs的方法有：a)贴壁法。所得细胞成分复杂，BMSCs的纯度不足；b)密度梯度离心法。该方法基于沉降作用，这是较简便且实用的分离方法，它能有效地将红细胞、白细胞和间充质细胞分离开来。Lisignoli［1］研究发现，密度梯度离心法能增加BMSCs分化成为成骨细胞克隆的数量；c)流式细胞仪法；d)免疫学方法。免疫选择法通过骨髓基质干细胞表

4、面带有或缺乏某些抗原标志，进行筛选，可获得相对纯化的基质干细胞。赵子义等［2］研究发现，利用免疫磁珠标记神经生长因子受体(nervegro2)BMSCs无论在扩增速度还是扩增倍数上都明显高于高密度接种，而极低密度接种(0.5～12/cm2)更有利于细胞的增殖。杨柳等人［3］在实验中也发现种植密度较高时，严重影响BMSCs的贴壁生长，考虑为含有的红细胞、白细胞比重大于BMSCs而首先沉积于瓶底，且细胞代谢废物增多所至。　　BMSCs成骨活性随着供体年龄增长呈下降趋势，年龄越大，在培养中形成的群落和

5、具有成骨样细胞特点的细胞越少，而且细胞对诱导因子的反应敏感性下降。　　低氧张力条件下BMSCs培养，其细胞增殖速度大大提高，且细胞ALP表达也大大增强［4］。考虑其原因为机体内部的氧分压明显低于外界(140mmHg)，特别是骨髓内氧分压只为30～50mmHg，大约相当于外界的1/3，因此BMSCs长期暴露于高氧分压的状态，必将导致细胞过度氧化，功能下降。如果体外进行培养的条件与体内氧分压相似，则更有利于细胞功能的保留。　　顾祖超等人［5］在实验中发现，兔BMSCs原代培养，其开始贴壁(1～2d)

6、的时间和完全贴壁时间(12～14d)均长于传代培养的BMSCs。传代BMSCs不形成集落，形态更加单一，呈梭形，14d之内没有形成明显钙化结节。BMSCs经诱导培养后的形态主要为多角形，其贴壁率有所下降，且在10～12d之内形成明显钙化结节。传代细胞和诱导细胞两者的生长曲线无统计学差异，倍增时间为33.6～34.6h，生长高峰均在接种后6～7d出现。BMSCs长满单层后，可出现多层生长，没有发生接触抑制。　　Sun等人［6］的研究还发现大鼠BMSCs抑制T淋巴细胞的扩增，认为此特性可使其应用于同

7、种异体移植。Cancedda［7］指出，经过体外扩增，BMSCs在体内的成骨效率明显低于新鲜的骨髓，其在体外的多项分化潜能逐渐消失。　　3骨髓基质干细胞的诱导分化　　由于BMSCs具有分化多方向性的特点，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，所以BMSCs的定向诱导具有重要作用。就其成骨方向来说，具有诱导作用的有以下几种因素。　　3.1化学物质的作用　　3.1.1地塞米松(Dex)Beresford等［8］发现在原代及传代细胞培养中均加入地塞米松时，骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞转化，在传代培养

8、中再加入1，25二羟维生素D3，则抑制其向脂肪细胞转化，通过骨钙蛋白mRNA分析证实向成骨细胞转化占优势。而仅在传代培养中加入地塞米松时，骨髓基质细胞多向脂肪细胞转化。　　而Maniatopoulos［9］认为只有在地塞米松和β甘油磷酸钠存在的培养环境下，才能形成矿化骨样小结，形成矿化小结的时间、形状、数目与地塞米松加入的时间及剂量有关。　　3.1.21，25羟基维生素D3(1，25(OH)2D3)Kelly等［10］发现1，25(OH)2D3在促进BMSCs向成骨细胞分化的同时，能够抑制由糖