人cc10基因在肺腺癌a549细胞中的表达论文

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1、人CC10基因在肺腺癌A549细胞中的表达论文【关键词】CC10基因ExpressionofHumanCC10GeneinLungAdenocarcinomaA549CellAbstract：ObjectiveToconstructandidentityhumantheexpressionplasmidpcDNA3.1hCC10.MethodsA273bpcDNAfragmentplifiedfromthetotalRNAofnormallungtissuebyRTPCR,theninserteditintoexpressionvectorpcDNA3.1byDNA

2、rebinanttechniques.MLV逆转录酶的作用下完成cDNA第一链的合成。以新合成的cDNA为模板，加入上游引物：5’TACACAGTGAGCTTTGGGC3’及下游引物：5’ATGAAACTCGCTGTCACCC3’，在PE480扩增仪上扩增，扩增参数为：94℃45s,55℃1min,72℃1min,循环35次，PCR产物用1.5%琼脂糖电泳。1.2.3人重组真核表达质粒pcDNA3.1hCC10的构建将PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖电泳后回收、纯化后连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α。在

3、含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，随机挑取单个菌落，摇菌培养，小提取试剂盒提取质粒DNA进行初筛。重组真核表达质粒pcDNA3.1hCC10的构建。1.2.4CC10DNA序列测定用双酶切法分解扩增后的阳性重组质粒pcDNACC10，回收目的基因DNA，采用Sang双脱氧法行序列测定（上海博亚公司）。1.2.5基因转染A549肺腺癌细胞株接种于6孔培养板，在RPMI1640培养基（含10%FCS），37℃，5%CO2的条件下行常规培养，细胞培养至70%，按试剂盒的步骤行脂质体转染，并设空质粒对照组及空白对照组。1.2.6细胞免疫荧光观察CC10蛋白质表达转染4

4、8h后，将转染的A549细胞爬片分别用40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次。依次加入50μl1∶200CC10一抗、二抗及1∶100鼠抗人IgGFcFITC荧光抗体100μl，制片后立即于倒置荧光显微镜摄像。1.2.8arkers的250bp附近，见图1，与预期的273bp目的片段大小接近，表明扩增片段是我们所需的目的基因片段。2.2人CC10真核表达质粒的酶切鉴定用HindⅢ和BamHⅠ双酶切对真核表达载体pcDNA3.1hCC10鉴定结果表明，获得预期大小(273bp)的DNA片段及5.4kbp大小的pcDNA3.1片段，见图2。2.3序列测定结果电

5、泳回收的PCR产物经小提试剂盒抽提，纯化后用酶切分析方法对PCR产物进行测序。DNA序列分析证明与已报道的基因序列一致，其序列为：atgaaactcgctgtcaccctcaccctggtcacactggctctctgctgcagctccgcttctgcagagatctgcccgagctttcagcgtgtcatcgaaaccctcctcatggacacaccctccagttatgaggctgccatggaacttttcagccctgatcaagacatgagggaggcaggggctcagctgaagaagctggtggacaccctcccccaaaagcccagag

6、aaagcatcattaagctcatggaaaaaatagcccaaagctcactgtgtaat2.4转染真核表达质粒后A549细胞CC10蛋白的表达免疫荧光染色可观察到在未行转染的A549细胞浆中有少量的阳性物质表达，胞核则未见绿色荧光，见图3a；而转染hCC10基因的A549细胞浆中绿色荧光阳性物质表达明显增加，部分胞核亦可见绿色荧光。结果表明CC10蛋白在胞浆及胞核均有表达，其中以胞浆为主，见图3b。A.Mammaglobin,abreastspecificgene,anditsutilityasamarkerforbreastcancer［J］.AnnNY

7、AcadSci,2000,923:7889.7PatiernoSR,ManyakMJ,FernandezPM,etal.Uteroglobin:apotentialnoveltumorsuppressorandmoleculartherapeuticforprostatecancer［J］.ClinProstateCancer,2002,1(2):118124.8ShijuboN,HonndaY,ItohY,etal.BALsurfactantproteinAandClaracell10kDaproteinlevelsinhealt