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1、嗅黏膜嗅鞘细胞的实验研究概述论文【关键词】嗅鞘细胞嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)在功能上是介于施万细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊的胶质细胞,具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等，为轴突生长提供了适宜的微环境及较强的迁移的特性，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。嗅鞘细胞同胶质细胞、施万细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅黏膜中的神经元是唯一的生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿为4～12周，随着
2、新细胞的生长.freell,接种于无包被的玻璃培养皿,置CO2培养箱内(37℃,5%CO2)培养。每2～3天换液一次。当将离体嗅黏膜制成细胞悬液后,细胞之间的平衡即被打破,接触抑制及反馈调节机制亦被解除。细胞悬液中的神经干细胞在其他细胞分泌的细胞因子和细胞外基质的作用下,将进入细胞分裂、增殖周期。整个培养过程,更换培养液也十分关键。嗅黏膜OECs贴壁生长时间较晚,一般在培养第5～6天才开始,不像嗅球OECs24h后就大量贴壁生长。所以在这段时间内换液应十分小心,尽量不要晃动培养液,以保持细胞沉淀,根据情况最好行1/3量换液或根据培养液的颜
3、色添加培养液,以免丢失细胞。纯化：按改良Nash差速贴壁法在培养36～48h后,将培养液吸出,重新种植于包被多聚右旋赖氨酸的24孔细胞培养板内,进行纯化培养。纯化培养液中可加入20μmol/L的Forskolin和20μg/ml的BPE(bovinepituitaryextract)以促进细胞的生长培养14天,其间观察细胞生长情况,间或摄片。成纤维细胞的生长可机械刮除亦可用5μmol/LArac处理24h来控制。Arac对OECS的生长也有抑制作用，故有学者也不主张使用。是否纯化的观点：有部分学者认为根据嗅黏膜细胞的社会学特性,即各种细胞
4、之间存在着相互依存、相互诱导、相互制约的调节机制。嗅黏膜神经干细胞和嗅鞘细胞体外培养时,不宜过早地纯化细胞,混合细胞培养更有利于各细胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神经干细胞克隆球的形成。Shou等［7］将嗅上皮细胞与其基底细胞共培养发现,后者能促进神经前体细胞的增生,其实验结果从另一侧面证明了上述观点。4嗅黏膜细胞的免疫细胞化学染色目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，体外培养的时间不同，免疫反应阳性细胞形态亦不相同，成熟的嗅鞘细胞大多为梭形双极细胞,突起细长,其走向具有明显的方向性,细胞
5、排列成束。5原代培养嗅黏膜细胞的生长特点嗅黏膜细胞接种于培养皿24h内除少数球形细胞悬浮外,大部分细胞已贴壁,贴壁细胞多呈扁平多边形,单层片状生长。此后可见散在的球形细胞粘附于扁平细胞表面并分裂增殖,逐渐形成克隆球。于培养早期可见少数克隆球首先悬浮生长,几天后贴壁生长并逐渐分化。克隆球于1周内生长较快,随着球体增大其生长逐渐变慢,2周后直径至1mm左右,球体不再生长,自克隆球周边有球形细胞向外迁移,迁移出的细胞大多最终分化成梭形的嗅鞘样细胞,细胞排列方向性较为一致;少数分化成嗅细胞样细胞,胞体为卵圆形具有两根突起。突起一根细长,多贴附于梭
6、形细胞上,另一根较粗短,顶端隐约可见嗅毛。形态多为双极或三级。改良差速贴壁法细胞生长特点：一般细胞培养7～8天后,增殖最快,数量明显增多,细胞成分以梭形(双极)和多突起的大细胞为主,常呈成团生长,但联系松散,生长缺少方向性。据报道［8］这些梭形和双极细胞主要是OECs和嗅神经元,有部分窝形细胞属上皮细胞,大细胞可能是未分化的神经胶质细胞。培养至14天以后的细胞,形态没有大的变化,主要为双极和梭形细胞,但数量往往开始减少，杂细胞占优势。Forskolin和BPE的应用可以大大促进细胞的生长。杂细胞主要是成纤维细胞,也有明显生长,需应用Ara
7、c进行纯化，或者采用机械刮除。改良差速贴壁法，培养至14天的OECs免疫组化染色结果表明,大部分双极或梭形细胞呈GFAP或p75NGFR免疫反应阳性。6同其他干细胞的比较干细胞移植治疗中枢神经系统疾病已经有了较大进展,但是目前还存在一些问题有待解决:（1）神经干细胞的分化取决于神经营养和生长因子、细胞因子、细胞外基质分子、细胞黏附分子、细胞-细胞接触和神经变性等的作用。干细胞有可能使受损的脑组织建立神经连接,但原发和继发的损伤事件如中性粒细胞和巨噬细胞侵入、神经元和胶质细胞死亡将影响移植的干细胞的分化;（2）虽然干细胞具有低免疫原性的特点
8、,但仍存在异体移植排斥;（3）不管是在体外培养条件下还是体内环境下神经干细胞都会有很大一部分分化成星形胶质细胞,形成星形胶质的瘢痕,使干细胞分裂、分化和迁移、并形成有功能的正常神经元网络是非常
