瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究论文

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1、瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究论文目的观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.43±0.12),差异有非常显著意义(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论瘢痕成纤维

2、细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均有着积极作用。Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibr

3、oblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).EM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。1.3成纤维细胞培养手术切取增生性

4、瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。1.4CRT免疫细胞化学染色体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。1.5CRT

5、原位ELISA检测［7］选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%TritonX-1004℃作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗体(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反应。E

6、LISAreader上读取492nm的P值。2结果2.1成纤维细胞初代培养结果在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。2.2成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的

7、CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。2.3成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果根据CRT免疫细胞化学染色结果，我

8、们对第5代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的CRT表达值为1.43±0.12(A)，瘢痕成纤维细胞组为1.97