耐亚胺培南铜绿假单胞菌carb

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1、耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)是临床常见的条件致病菌,由于其固有和获得性耐药,使临床治疗成为一大难题。CARB基因编码产生羧苄西林酶,为β-内酰胺酶Bush分类中的2c,在我国CARB基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了2005年1~12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa),发现了我院IMPRPa携带CARB-3基因,现总结报告如下。  1材料与方法  1.1菌株来源与质控菌株34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1~12月我院住院病人的临床分离标本(包括:痰液、

2、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等),质控菌株包括:铜绿假单胞菌ATCC27853,大肠埃希菌ATCC25922。  1.2菌株鉴定及亚胺培南耐药菌株筛选试验菌株经BDPhoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种,采用该仪器配套药敏试验复合板筛选亚胺培南耐药的Pa。  1.3主要仪器设备与试剂Eppendorfcentrifuge5417R低温离心机,恒温金属浴(杭州大和),MJPeltierThermalCycler(MJResearch),Bio-RAD电泳仪,Bio-RAD凝胶成像系统,琼脂糖(OXOID),100bpDNALadderMarker(大连宝森)

3、,6×Loadingbuffer(北京天为时代)。  1.4模板DNA提取采用蛋白酶K消化法。  1.5基因扩增引物序列为:P1:5′-AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC-3′,P2:5′-TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC-3′,扩增产物为588bp。热循环参数为:93℃预变性3min,93℃60s,55℃60s,72℃60s,最后一个72℃延伸5min,共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。  1.6结果判断取10μl扩增产物与2μl6×上样缓冲液混匀,点样于1.5%琼脂糖凝胶,在100V电

4、压电泳30min,出现588bp的条带即为CARB基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。  1.7序列分析PCR产物经纯化后送上海生工生物工程公司进行DNA序列分析,测得序列在.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST中的BLASTn程序进行同源性和基因亚型分析。  2结果  2.1CARB基因PCR检测结果34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌共检出11株CARB基因阳性株,检出率为32.4%,PCR扩增结果见图1。  2.2序列分析结果任意抽取5株CARB基因阳性的PCR扩增产物进行单向测序,测得序列与GenBank中注册号为DQ309773的CARB-3基因完全同源

5、(Identities=100%)。因此我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。  图1部分Pa菌株CARB基因PCR产物电泳图 (略)  3讨论  CARB基因最早于1981年在Pa中发现[1],近年又从不动杆菌、弧菌属、奇异变形杆菌中检出,已发现CARB1-9型9个亚型[2~4]。我院IMPRPa的CARB基因携带率为32.4%,提示医务工作者应重视和加强Pa的防治和耐药监测。对CARB基因阳性菌株进行DNA序列分析,经同源性比较,结果显示:我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。IMPRPa中CARB基因检出、CARB-3基因亚型发现为国内首次报道。

6、  铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌,正常情况下不感染人体任何组织,但当人体免疫力下降或严重创伤或医疗操作后,Pa几乎可以感染人体的任何组织,临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染,常常危及患者生命。碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南)因其独特的抗菌优势,被临床广泛用于Pa引起的重症感染,导致临床分离株对亚胺培南耐药性增加。  Pa对亚胺培南耐药的机制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和产酶等三种机制[5]。我们对IMPRPa的耐药机制的相关研究正在进行中。    【参考

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