腺病毒介导的 p53 基因对人肝癌细胞抑制作用的实验研究论文

《腺病毒介导的 p53 基因对人肝癌细胞抑制作用的实验研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、腺病毒介导的p53基因对人肝癌细胞抑制作用的实验研究论文田耕刘积良董洪松陈伟红谭淑瑜【摘要】目的：研究重组腺病毒介导的野生型p53基因对人肝癌细胞系HepG2的抑制作用。方法：用MTT比色法检测重组人p53腺病毒（Ad-p53）在不同感染滴度、不同感染时间对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用，用流式细胞仪检测Ad-p53作用后HepG2细胞的凋亡率；采用瘤内注射的方法观察Ad-p53对裸鼠移植瘤的抑制作用。结果：Ad-p53对HepG2细胞有明显的抑制效应，效靶比（MOI）越高、作用时间越长，抑制作用越强；当rAd-p53在125MO

2、I效靶比时，细胞生长基本达到完全抑制；p53转导显著增加了HepG2细胞的凋亡率；瘤内注射Ad-p53后，荷瘤裸鼠的肿瘤生长受到明显抑制。结论：Ad-p53对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制效应，其抑制效应具有时间、剂量依赖关系，Ad-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的肝癌基因治疗途径。【关键词】肝癌；腺病毒；p53；基因治疗〔Abstract〕ObjectiveToexplorethepotentialuseofadenovirusmediatedp53gene(Ad-p53)therapyforhepatocellular

3、carcinoma.MethodsAhumanhepatocellularcarcinomacelllineHepG2ornodulesinvivo.Thegroanodulesinnudemiceined.Cellapoptosisetrymethod.ResultsCellgrooralinjectionofAd-p53significantlyinhibitedhepatocellularcarcinomaimplantedxenograft.ConclusionTransfectionofa.〔KeyOI）感染细胞，对照组不加

4、药，每一MOI值重复6孔。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养10h后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，每孔加入50gMTT，孵育4h后二甲基亚砜（DMSO）终止反应，酶标仪测定光吸收度。1.3MTT法检测病毒感染时间与细胞存活的关系将HepG2细胞按每孔500个细胞分别接种于96孔板内，第2天用Ad-p53以125MOI感染细胞，对照组不加药，每一时间值重复6孔。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中分别培养30、60、90、120、150min后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，24h后换新鲜培养液，每孔加入50gMTT，孵育4h后DMSO

5、终止反应，酶标仪测定光吸收度。1.4台盼蓝染色绘制细胞生长曲线将HepG2细胞1×105接种于60mm的平皿，培养到约70%汇合，细胞计数，吸出培养液，125MOI值的Ad-p53和空载体腺病毒Ad-LacZ感染HepG2细胞，设空白对照，每天观察细胞生长状况，于感染的2、4、6、8d，用2.5g/L胰蛋酶消化细胞，离心收集细胞，台盼蓝染色，细胞计数，每皿重复3次，取平均值，绘制细胞生长曲线。1.5AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡分别取5×105个对数生长期HepG2接种于6孔板，125MOI值的Ad-p53、Ad-LacZ

6、及PBS作用24h后收获细胞，每个标本加入AnnexinV2L、PI荧光抗体2L，室温避光双染色15min，加入400L结合缓冲液，上流式细胞仪检测分析，获得标记阳性的细胞，计算细胞凋亡率。1.6Ad-p53对裸鼠移植瘤生长的抑制作用HepG2细胞在37℃，5%CO2，含10%小牛血清的RPMI-1640的培养基中培养，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用无菌PBS液重悬制成5×107/mL的单细胞悬液，每只裸小鼠于右侧后肢外侧皮下接种0.2mL(1×107)细胞悬液，共18只。接种6d后，将荷瘤裸鼠随机分为3组，每组6

7、只，于肿瘤结节（或肿瘤接种部位）内分别注射0.1mL的PBS液或含有5×107pfu的Ad-LacZ、Ad-p53。每隔3d注射1次，共注射5次，每次注射前测量肿瘤体积。游标卡尺测量肿瘤结节的长度（a）和宽度（b），按公式V=ab2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。1.7统计学处理实验结果以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行配对t检验。2结果2.1病毒感染滴度与细胞存活的关系与空白对照相比，Ad-p53对HepG2细胞有明显抑制作用，随着MOI的增加，野生型p53（in时，HepG2细胞基本达到完全抑制（图2）。2.3Ad

8、-p53对肝癌细胞生长抑制的检测125MOI值的空载体腺病毒Ad2LacZ对HepG2细胞的生长影响与对照组相比没有差别，而以125MOI值的Ad-p53感染HepG2细胞能对细胞生长产生明显抑制（P0.01，图3）。这