家猪百日胚胎胸腺的基因表达谱

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1、家猪百日胚胎胸腺的基因表达谱作者：陈艳炯，邓亚军，叶琳，耿佳宁，李生斌【关键词】猪　　Geneexpressionpatternin100dayporcinefoetusthymus　　【Abstract】AIM:Togetabetterunderstandingofthethymusdevelopmentanddifferentiation，us(FTY).METHODS:11712randomlypickedclonesfromFTYcDNAlibraryinationoved,7071cleanedESTsologuesinnonredundantnuclEica

2、ciddatabase,theSan,cattleandmouse.The1629ESTsilaritiesusfunctionalgenesilartohumaninfantthymusgeneexpressionprofileanddifferentfromthatofadulthuman.Blastsearchfoundthat58of109novelsequencesologuestohumangenomesequence.CONCLUSION:ESTstrategyiseconomicalandvirtualinfindingneusisstillatadev

3、elopmentalstage.　　【Keyusgland/embryology;EST　　【摘要】目的：构建家猪100d胚胎胸腺基因表达谱，为研究胸腺的发育和分化机制奠定基础.方法：随机挑取家猪100d胸腺cDNA文库（FTY）的11712个克隆，进行单向全自动大规模测序，去污染后共获得7071个高质量的表达序列标签(EST)用于基因表达分析.结果：对7071个高质量EST的聚类分析结果获得959个多拷贝基因和3074个单拷贝基因.与非冗余的核酸数据库、SRNA构建的cDNA文库中随机取出一个克隆，从5′末端或3′末端对插入的cDNA片段进行单向（singlepass

4、orsinglerun）自动测序，所获得的长约60~500bp的一段cDNA序列.通过对EST进行分析，有助于新基因的发现和克隆，为人类基因组图谱绘制、基因组编码区序列的确定、分析基因在不同组织中的表达特异性提供序列信息［1,2］.目前EST技术已经广泛应用于比较基因组学、功能基因组学和疾病基因组学等研究领域，并且已经成为连接基因组学和后基因组学的桥梁和工具.　　胸腺是T细胞发育的场所.淋巴样干细胞迁入胸腺进行分化，约95%以上的胸腺细胞死亡，只有不足5%的细胞存活，分化为成熟的辅助T细胞及细胞毒性T细胞，输出胸腺，定位于外周淋巴器官及组织.在孕14alGeicsDep

5、artmentofAnimalScienceAnimalHealthTheRoyalVeterinaryandAgriculturalUniversity提供.文库构建载体为pBluescriptSK(+).ETdyeterminatormix，MegaBACETMLongreadMatrix，MegaBACELPAbuffer，MegaBACE1000核酸分析仪、VDS均购自AmershamPharmacia公司；Eppendorf5810R离心机；ABI9700PCR仪，鼎国公司生产T7引物等.　　1.2方法　　1.2.1ESTs序列测定用碱裂解法进行测序模板制备；

6、用ddNTP荧光标记的末端终止法进行测序反应；毛细管电泳测序.　　1.2.2信息收集与处理basecalling软件读取胶图文件；phred程序（trim_cutoff默认为0.05）,去除克隆中的低质量部分［4,5］；phd2fasta软件将PHD格式文件转化为FASTA格式的文件；crossmatch软件通过与载体序列数据库进行比较后进行载体屏蔽（vectormask），提取每一克隆中无载体污染的最长片段，提取出超过100bp的形成新的高质量克隆.　　1.2.3聚类分析利用Phrap软件,对cleanedests（高质量ESTs）进行聚类,得到多拷贝基因（clust

7、ers）及单拷贝基因（singletons），合起来称作Unigenes.　　1.2.4数据比较将得到的Unigenes与Genbank中非冗余核苷酸库进行比较，blastn标准(e值=1e-10)与Genbank中的蛋白质数据库进行blastx比较，blastx标准(e=1e-5)，与Genbank中的Unigene人（UnigeneHS）、牛（UnigeneBt）、鼠（UnigeneMM）数据库进行比较(e=1e-10)；利用比对结果去除线粒体、细菌基因组、重复序列和核糖体RNA；对聚类后的Unigenes进行ORF预测及加尾信号分析