人oaz突变基因的克隆构建及重组蛋白表达论文

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1、人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达论文姜立马文丽柯杰兵彭翼飞李晋徐兵郑文岭【摘要】目的构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全

2、长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45900左右出现新的蛋白条带。结论成功构建人OAZ突变基因重组质粒.freele,OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shiftin

3、g的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度保守的ORF2产物的组合。在OAZmRNA的阅读框中，需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的5′端终止密码子处，通常序列为TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻译框架达到TGA时，如果没有精胺的存在，核糖体将接受TGA为终止密码子，翻译到

4、此终止。当精胺浓度一定时，核糖体的翻译即可受到精胺的调控进行+1移码，跃过终止密码子TGA上的T，以GAT指导的天冬氨酸为后续，翻译合成ORF2［4-5］。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控，表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性，反向调节细胞内多聚胺的水平，从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中，普遍发现了ODC的高表达，因此，OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能，就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导，缺乏精胺时，核糖体将不能进行+1的移位，翻译完整

5、的全长OAZ蛋白。为此，本研究对OAZ基因进行了特定T碱基的缺失突变，成功构建至表达载体pET-32a中，测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白，将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备，具有重要意义。1材料和方法1.1试剂大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-g/L)1μl、dNTP1μl、10×Buffer5μl、P1与P2引物(100mg/L)各2.5μl、PfuTurboDNA多聚酶

6、(2.5×106U/L)1μl、双蒸馏水37μl加入PCR管;95℃预变性30s后，95℃30s、55℃1min、68℃6min，共18个循环。PCR产物置于冰上2min,加入1.5μlDpnⅠ内切酶(106U/L),37℃水浴2h，酶解模板DNA。1.2.2转化大肠杆菌DH5α取感受态大肠杆菌50μl,加入上述DpnⅠ处理液10μl,轻轻混匀,冰浴30min→42℃热休克45s→冰上2min，加入预热的LB培养液0.5ml,置于37℃恒温摇床中,200r/min振摇1h。1.2.3质粒扩增、提取及鉴定取200

7、μl菌液铺到LB琼脂培养板(含Amp)上,37℃培养12～16h。挑取单菌落,提取质粒。取质粒5μl,选取插入片段两端的酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后，命名为pET-32a-OAZ-mutation。1.2.4重组蛋白表达将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌，铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后，接种至含5mlLB培养基中（含氨苄青霉素）振培过夜。次晨取100μl接种至新的5mlLB培养基中，3

8、7℃振培3～4h，至D值约为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5mmol/L，继续培养2h和4h后取菌液1ml，进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。2结果2.1pET-32a-OAZ-mutation测序图PCR扩增后，DpnⅠ酶切产物并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克