cla对hepg2细胞脂肪堆积的影响论文

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1、CLA对HepG2细胞脂肪堆积的影响论文.freelol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用细胞24小时，采用油红染色、RT-PCR等方法检测肝脏脂肪沉积、ACCmRNA表达，观察CLA对肝细胞内脂质沉积的影响。结果CLA增加HepG2细胞中脂质沉积，50μmol·L-1CLA组细胞中红染脂滴与对照组相比明显增多；CLA使HepG2细胞培养液中游离脂肪酸降低，50μmol·L-1组的培养液中游离脂肪酸与对照组相比含量降低了50%（P0.05）；CLA增加HepG2细胞ACCmRNA的表达，A

2、CCmRNA表达水平随CLA浓度增加而增高。结论CLA可增加HepG2细胞的脂肪沉积；其机制可能与CLA能够改变肝细胞中ACC的表达有关。【关键词】共轭亚油酸(CLA)HepG2细胞脂肪代谢ACC共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacids，CLA)是由一组具有共轭不饱和双键的亚油酸的异构体构成的混合物。1987年MichaelPariza研究小组分离出CLA.freelresco公司；油红O-0625，Sigma公司，共轭亚油酸（CLA），Sigma公司；游离脂肪酸测试盒南京建成科技有限公司；TRI

3、ZOL，Invitrogen公司；反转录试剂盒Fermentas公司葡萄糖试剂盒，上海复星公司。1.3主要仪器与设备NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差显微镜，YI-875SA医用超净工作台，酶联免疫检测仪，MyCyclerthermalcycle，凝胶成像仪等。1.4引物引物由奥达公司合成，其中ACC引物为：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’-TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。β-ACTIN引物为：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGT

4、ACATGGTGGTGCC-3’。2实验方法2.1细胞培养HepG2细胞置于含10％新生小牛血清的高糖DMEM培养液中，含有100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温孵箱条件下培养，用胰蛋白酶消化液消化。2.2油红O染色观察HepG2细胞脂质沉积将HepG2细胞接种于放有干净盖玻片的6孔板内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，加入不同浓度CLA作用24小时后，终止培养；弃培养液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室温孵育5分钟。除去甲醛溶液

5、，加入同等体积的10%甲醛室温孵育1小时，用锡纸包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的异丙醇冲洗，完全干燥；加入油红O工作液放置10分钟，除去油红O立即用蒸馏水冲洗4次，晾干后在倒置显微镜下观察。2.3染色法测定培养液中的游离脂肪酸将HepG2细胞以每孔5×104个细胞接种于24孔培养板内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，将实验组分为1%血清的DMEM培养液空白对照组（无细胞），正常细胞对照组（含1%血清的DMEM培养液）、CLA干预组(浓度为0、10、50、100μmol

6、·L-1)，每组设3孔并列，孵箱中培养24小时后吸弃培养液，CLA干预组每孔加入1ml100nmol·L-1的胰岛素溶液作用1小时后，按照试剂盒说明书方法，采用比色法测定培养液中游离脂肪酸的变化，同时24孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数。2.4胞总RNA的提取用TRIZOL试剂按操作说明书提取，提取的RNA用约25μLDEPC处理水溶解。2.5RNA纯度鉴定取RNA5μL，稀释100倍后用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，并计算OD260/OD280值及RNA浓度。2.6cDNA的合成（1）以提取的总

7、RNA3μg为模板，cDNA合成反应体系为12μL，包括：提取的总RNA模板3μg，PrimerOligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水补至12μL。3-5sec离心混匀，65℃加热5min后置于冰浴中。（2）逆转录反应反应体系包括：5×RTbuffer4μL；RNaseInhibitor1μL；10mMdNTPmix2μL；ReverTraAce1μL；补水到20μL。3-5sec离心混匀，37℃孵育5min后冰浴。（3）加入M-MuLV反转录酶1μL，总体积为20μL。离心混匀，3-5s，42℃孵育6

8、0min。（4）70℃加热10min以终止反应。合成的cDNA保存于-20℃或用于扩增。2.7PCR反应体系10×ReactionBuffer5μL；10mMdNTPs1μL；Primer1(P1)和Primer2(P2)各20pmol；cDNA2μL；KOD-Plus1μL；H2O33μL，总体积为50μL。PCR扩增条件为:解链95℃，60s；聚合55℃