三七皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关基因表达的影响

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1、三七皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关基因表达的影响【摘要】目的：研究三七皂苷(PNS)对脑缺血再灌注后大鼠脑海马和皮质形态学变化、Bcl2、Bax蛋白表达及神经细胞凋亡的影响。方法：采用线栓改良法复制大鼠左侧大脑中动脉闭塞(MCAO)建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2小时，再灌注24小时。将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、三七皂苷组、尼莫地平组和三七皂苷加尼莫地平组（联合用药组），每组10只。分别采用HE染色检测大鼠脑组织皮质和海马区病理改变，TUNEL法检测各组脑内皮质和海马区细胞凋亡变化，

2、免疫组化染色观察各组大鼠脑内皮质和海马区Bcl2、Bax蛋白表达。结果：与模型组相比，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠光镜下细胞损伤变性程度轻；细胞凋亡率下降（P均<0.01），三七皂苷组与尼莫地平组相比，细胞凋亡率无显著性差异（P>0.05），与联合用药组相比，有显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，三七皂苷组、尼莫地平组、联合用药组大鼠缺血区皮质和海马Bcl2阳性细胞数均明显上升（P均<0.01），Bax阳性细胞数的表达在相同时间点减少（P均<0.01）。结论：三七皂

3、苷可抑制大鼠神经细胞凋亡，对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定保护作用,其机制可能与Bcl2表达增高,Bax表达降低有关。【关键词】大鼠脑缺血再灌注细胞凋亡Bcl2Bax三七皂苷缺血性中风是最常见的脑血管疾病，缺血再灌注损伤所致神经细胞凋亡已被证实,但其发生机制仍未完全明确。三七为五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的根，主要活性成分是三七总皂苷(Panaxnotoginoside,PNS),其块根中含皂苷约12%[1]。三七在缺血缺氧性脑损伤防治中广泛应用,但其对脑缺

4、血再灌注后海马和皮质神经细胞凋亡及Bcl2、Bax表达的影响报道较少。本实验通过观察三七皂苷对脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮质和海马区细胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表达的影响，探讨其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。1实验材料1.1动物及分组健康SD大鼠50只,雌雄不拘，清洁级，体重250～300g，由中英合资上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供[动物许可证号：SCXK（沪）20030002]，饲养于上海中医药大学附属普陀医院动物房[动物实验室许可证号为SYXK（沪）20052008]。大鼠经普通饲料适应性喂养1周后

5、，随机分为模型组、假手术组、三七皂苷组、尼莫地平组、三七皂苷合尼莫地平组（联合用药组）,每组10只。1.2药物及试剂三七皂苷注射液（昆明制药集团股份有限公司，商品名：血塞通注射液，规格：250mg/5ml/支），尼莫地平注射液（德国拜耳医药保健股份公司,规格：10mg/50ml/支）；免疫组化检测试剂盒Bcl2、Bax抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），TUNEL试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。1.3主要仪器LEicaRM20型石蜡切片机，PhilipsTeai12Biotg/kg；尼莫地平组给予尼莫

6、地平20mg/kg；联合用药组给予三七皂苷45mg/kg，加尼莫地平20mg/kg；假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。造模前6天给予腹腔注射上述剂量药物,第7天给药30min后造模,1天1次，造模后2小时给药1次。给药期间常规自由喂养、给水。2.2大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备及筛选2.2.1模型制备采用改良Longa[1]线栓法制备模型。腹腔注射10%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)麻醉，背位固定大鼠后，剃除颈部体毛，局部消毒。切开颈正中皮肤3cm，暴露左侧颈总动脉(CCA)，自CCA分叉处向头端依次游

7、离，双极电凝器烫掉颈外动脉(ECA)的细小分支，然后在颈外动脉距颈总动脉分叉0.5～1cm处结扎，切断ECA，并使其游离并套线备用。分离颈内动脉(ICA)至颅底,分离其分支翼腭动脉，如不分离夹闭，尼龙线可能进入这个分支。用动脉夹暂时夹闭左侧CCA和翼腭动脉,用弹簧剪在游离的ECA残端剪0.2mm小口,将预先制备好的40的强生尼龙线(直径0.20mm,长50mm)入ECA残端小口内,将尼龙线缓慢沿ICA向颅内推进,进线约22mm,略感阻力，证明栓线头端已达到大脑前动脉,阻断了大脑中动脉的所有血液来源，包括来自颈内动

8、脉、大脑前动脉、大脑后动脉的血流，缝合切口。将尼龙线留置2个小时后，再灌注24小时将栓线抽出约10mm,拔线时有脱空感即止，将远端剪断10mm，以防动物苏醒后将线栓抓脱，导致大出血死亡。假手术组仅做颈动脉分离。2.2.2动物模型成功标准动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。按Longa5分制评分:0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展对侧前肢；2