亚洲牛带绦虫成虫延伸因子

《亚洲牛带绦虫成虫延伸因子》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、亚洲牛带绦虫成虫延伸因子：申萍香，吴璇，黄江，胡旭初，余新炳，包怀恩，廖兴江【摘要】目的对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongationfactor1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，用蛋白印迹法(ethodsByscreeningthefulllengthcDNAplasmidlibrary,the

2、codingregionofEF-1plifiedatography,anditsimmunogenicityedigestionandDNAsequencingconfirmedthattherebinantexpressionplasmidmunizingtheserumofsmunogenicity.ConclusionAnovelgenecodingEF-1ofTaeniasaginataasiaticaportanceforfurtherresearchonthebiologicalfunctionofthegene.　　KEYBI公司；DNA凝胶回收试剂

3、盒、质粒纯化试剂盒购自北京赛百盛基因公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、DAB(3，3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TMB显色试剂盒购自美国BD公司；SDS、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、尿素等试剂均购自上海申友生物科技公司。　　1.1.4引物合成和DNA测序　　基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1EF-1基因的识别　　将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，获得编码亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因文库质粒

4、编号为T.aHC23-E9，GenBank登录号为EF420501的同源基因；并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,ca.expasy.org/)预测其理化特性。1.2.2EF-1基因的扩增根据已获得的EF-1编码序列，利用DNAClub和PCRdesign设计引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，带EcoRⅠ酶切位点；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，带XhoⅠ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中EF-1基因的克隆质粒为模板，94℃预变性5min后，热循环参数为

5、94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳回收。　　1.2.3重组原核表达质粒［pET-28a(+)-EF-1］的构建及鉴定　　将PCR产物和原核表达质粒pET-28a(+)经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。　　1.2.4重组蛋白的表达　　将确定能表达重组蛋白的单菌落接种于5mLLB培养基中，过夜培养后1∶100转接到1000mL培养基中，培养至A600约为0.6时加入

6、IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃、250r/min进行诱导。诱导4h后离心收菌，用SDS-PAGE检测蛋白质的表达。　　1.2.5菌体的裂解、重组蛋白可溶性判断及待纯化融合蛋白上清的制备　　取单菌落接种于1000mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至A600为0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，28℃震荡培养4h，4℃离心(6000g×10min)，收集菌液，按文献［5］的方法，每克菌(湿重)加入3mL裂解缓冲液，重悬细菌沉淀，裂解液冰上超声破碎(160in)，4℃13000r/min离心20min，收集上清和沉淀，分别取上清10μL加

7、入4×SDS上样缓冲液和沉淀微量加1×SDS上样缓冲液，煮沸5-10min后行150g/LSDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。　　1.2.7arker条带剪下，PVDF膜转入感染亚洲牛带绦虫猪和患者血清中(1∶100稀释)，室温孵育2h，PBS洗涤3次，每次5min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪和抗人IgG(1∶2000稀释)，室温孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min，DAB显色至出现目的条带，超纯水终止反应［6］。　　2结果　　2.1生物信息学分析　　该基因与细粒棘球绦虫EF-1基因(登录号为AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相