家蚕蛹特异表达卵黄原蛋白基因功能与转录调控研究

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1、家蚕蛹特异表达卵黄原蛋白基因功能与转录调控研究第一章文献综述1.1昆虫的繁殖在昆虫中雌性的繁殖在卵巢中进行。卵巢又分为卵巢管、输卵管、受精囊、附腺、交配囊和产卵管[1]。卵巢管（ovariole)是卵巢中卵形成的部位。一般a虫的卵巢管有4-10根，然而，一些物种中含有更多的卵巢管。卵巢管呈管状，由体细胞和生殖细胞构成。在每个卵巢管的尖端，一个生殖室储藏基础的生殖细胞。滤泡或卵室内部形成原卵区，并使卵沿着卵巢管逐渐成熟。图1.1是雌性家蚕(Bombyxmori,B.mori)内部生殖器的构造，包括卵巢管、输卵管、受精囊、附腺、交配囊和产

2、卵管。在卵形成过程中，卵黄在卵母细胞内大量积累，卵成熟时卵重的65%左右。卵黄是由各种大分子组成的复合物，包括蛋白质、脂类和碳水化合物，其中蛋白质是主要成分。因此，按其化学本质可分为蛋白性、脂肪性和碳水化合物性卵黄。蛋白性卵黄里球状，直径1.5-9.8Mm，脂质性卵黄主要是脂肪小滴，直径1.4*4.6,碳水化合物性卵黄主要是糖原颗粒，直径0.12nm。家蚕卵黄主要是由蛋白性卵黄球构成，被称为卵黄颗粒。其中以大型蛋白性卵黄球为最多，脂肪小滴和糖原颗粒分散于蛋白性卵黄球之间。.1.2卵黄原蛋白卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg)是

3、卵黄憐蛋白（egg-yolkproteinvitellin，Vn)前体。它是卵生动物特有的一类蛋白，主要功能是为胚胎的发育提供营养。早在1954年首次在桑香属中被证实为一种雌特异的血液蛋白[26]昆虫中，Vg的合成具有组织、性别和发育时期的特异性。它首先在雌性脂肪体中合成，分泌到血液，再通过胞吞的方式进入卵母细胞[27]。Vg被吸收到卵内，在枯草杆菌蛋白内切酶和蛋白前体转化酶的作用下切割成50-180kDa的亚基[28-29]，而以卵黄磷蛋白的形式存在。这些酶识别保守的基序(R/K)XX(R/K)作为切割位点，而这些基序在所有的昆虫V

4、gs氨基酸序列中都能找到[3]。在半变态的昆虫像P.americcma、Riptortusclavatus,Vg的初产物切割成多个亚基；而在完全变态的昆虫中，Vg的初始产物切割成一个大亚基和一个小亚基;与其他的膜翅目昆虫一样Vg在Pimpitipponiccj中并不被切割（Fig.1.3)。尽管其他的麟翅目昆虫的Vgs般被切割成大小两个亚基，但在草地贪夜蛾Sjporfoipfera的血淋巴和卵巢提取物中只检测到一种蛋白形式[30]。不同物种中的Vg基因的数目也不尽相同。果蝇Drosophilamelanogaster有三个卵黄蛋白基因

5、（yolkprotein，Yp)Ypl,取2和其中在雌蚕脂肪体中特异表达而则在卵巢滤泡细胞中特异表达[31-32]。这种组织，时期的特异性的转录是由组织特异的增强子，蜕皮激素和保幼激素共同调控的[33]。而在蚊子中有五个Vg基因，在雌性成虫食血后开始特异高量表达[34]?家蚕S.mon只有一个卵黄原蛋白基因(BmVg),在1994年被鉴定。它主要是在雌性幼虫到蛹变态期开始合成[35]。.第二章引言2.1研究背景昆虫是地球上数量最多的动物群体，它们的踪迹几乎遍布世界的每一个角落。目前，人类已知的昆虫约有100力种，但仍有许多种类尚待发现

6、。它以超强的繁殖能力著称，卵黄原蛋白作为昆虫胚胎的主要营养物质长期以来是研究者们广为关注的问题。从上世纪50年代Telfer从多音天蚕血液中分离得到这个血液特异的蛋白后，研究者从不同种类的昆虫中纯化卵黄原蛋白，克隆并分析不同物种中卵黄原蛋白基因结构，发现该基因的转录具有组织、时期和性别特异性，发现不同物种中脱皮激素和保幼激素对卵黄原蛋白基因的转录调控影响不同，在紋子和果顿的研究进一步阐述了卵黄原蛋白基因的组织、时期特异性表达的转录调控模式。在绝大多数昆虫中，卵黄蛋白的组成较简单，卵黄原/卵黄憐蛋白占卵黄蛋白的80%以上，被认为是胚胎发

7、育过程中必需的营养物质。而在有些麟翅目昆虫中，卵黄蛋白组成较复杂。例如在家蚕中由40%Vn、35%30KP蛋白和25%ESP组成。这种成份上的差异是否对卵黄原蛋白的重要性有所影响呢？.2.2研究内容结合家査基因表达芯片结果分析BmVg在雌雄个体中的转录趋势，然后用RT-PCR对此进行验证；SA实验分析BrC-Z2元件与有活性的BmBrC-Z2蛋白结合；过表达BmBrC-Zl、Z2和Z4转录因子分析说皮激素对BmVg启动子的作用是通过BinBrC-Z2调控的；定量PCR和免疫组化分析在家蚕幼虫-蛹变态过程中BmBrC-Z2与BmVg合成

8、的趋势;利用RNAi实验特异下调BniBrC-Z2在雌蚕的表达，分析BmVg的合成及卵的形成、胚胎发育；..第三章家蚕卵黄原蛋白基因的结构、表达特征..........193.1材料与方法.........193.1.1