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1、结缔组织生长因子在病理性瘢痕中的表达作者：陶常波，金培生，张爱君，李雪阳【摘要】目的探讨结缔组织生长因子（CTGF）在病理性瘢痕形成中的作用。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测10例瘢痕疙瘩（瘢痕疙瘩组）和10例增生性瘢痕（增生性瘢痕组）中的CTGFmRNA的表达，并以8例正常皮肤（正常皮肤组）作为对照。结果病理性瘢痕中CTGFmRNA表达均明显高于正常皮肤组（P<0.05），而瘢痕疙瘩组又高于增生瘢痕组（P<0.05）。结论CTGF在病理性瘢痕的形成过程中起到重要作用。【关键词】瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；结缔组织生长因子Ab
2、stract:ObjectiveToexploretheeffectofconnectivetissuegroerasechainreaction(RT-PCR)RNAin10casesofkeloid(keloidgroup),10casesofhypertrophicscar(hypertrophicscar)and8casesofnormalskin(normalcontrolgroup).Resultsparedalcontrolgroup,CTGFmRNARNAayplayanimportantroleinthepathogenesisofpat
3、hologicalscar. Keyogehizer公司);Eppendorf-5840R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；PCR扩增仪PTC-100(美国MJResearch公司)；电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统INGENIUS(美国基因有限公司)。 1.4实验方法 1.4.1引物准备 参照人CTGFcDNA序列，进行特异性CTGF引物设计，同时选取β-actin作为内参照。CTGF序列：上游5'-AACTATGATTAGAGCCAACTGCCTG-3'，下游5'-TCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC
4、-3',扩增片段长度为475bp，β-actin：上游5'-CCGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，下游5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGA-3'用这对引物可扩增β-actincDNA片段长度为781bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.4.2组织总RNA提取 取标本组织50mg，剪碎后加入1mlTRNzol试剂，电动组织匀浆器匀浆，其后操作步骤按照试剂说明书进行。抽提的总RNA测D260nm和D280nm，并计算比值为1.6～2.0，余下RNA加入30～100μl不含RNA酶的双蒸水,－70℃冰箱保存备用。
5、1.4.3逆转录（RT） 反应总体积10μl，RNA模板1μl(2μg),RNA酶抑制剂0.5μl，5×RTBuffer2μl,10mmol/LdNTP1μl,随机引物0.5μl，逆转录酶0.5μl，不含RNA酶的双蒸水4.5μl。按以下条件进行逆转录反应:室温10min，45℃45min，95℃5min，4℃5min。cDNA－20℃保存或直接扩增。 1.4.4PCR扩增 按以下条件配制反应液：10×PCRBuffer2.5μl,10mmol/LdNTP混合物0.5μl,5μmol/LCTGF上游及下游特异性引物各0.5μl,TapmixDNA聚合
6、酶0.5μl，RT产物2.5μl,加不含RNA酶的双蒸水18μl至总体积25μl。按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min,然后94℃30s,65℃30s,72℃7min,72℃5min,循环30次，末次延伸72℃5min。 1.4.5结果分析 取10μlPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（电压8V/cm）,溴化乙啶（EB）染色，以β-actin为内参照，设定值为1，经凝胶成像分析系统分析其灰度值并计算比值。 1.5统计学处理 采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，采用q检验进行两两比较，P＜
7、0.05为差异有显著性。 2结果 2.1PCR产物结果 3组PCR扩增产物经电泳分离并在紫外灯下观察，可见到位于781bp和475bp处各有1条特异性条带，与预期扩增片段长度相符。电泳结果见图1。 2.2各组间CTGFmRNA表达量（相对于β-actin）的比较 瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组CTGFmRNA表达量均明显高于正常皮肤组(P＜0.05），而瘢痕疙瘩组表达量又高于增生性瘢痕组（P＜0.05）。见表1。表13组间CTGFmRNA表达量的比较（略） 3讨论CTGF是1991年Bradham等［3］用亲和色谱法在人体脐静脉内皮细胞的条件培养基中
8、发现的，是一种富含半胱氨酸的多肽。在其他种属的动物如猪、牛、蛙等体
