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时间:2018-11-06
《半夏蛋白对人肝癌细胞bel7402的诱导凋亡作》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作【摘要】目的观察并比较半夏蛋白对体外培养的人肝癌细胞Bel7402的生长抑制作用。方法应用流式细胞技术,检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用,并观察了其诱导凋亡作用的量效关系。结果60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel7402细胞凋亡的作用,而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示,只有0.1mol/LNaCl洗脱峰有一定诱导Bel7402细胞凋亡的作用。结论半夏蛋白有一定的诱导Bel7402细胞凋亡作用,其主
2、要成分可能存在于总有机酸部位。【关键词】半夏提取物;人肝癌细胞Bel7402;细胞凋亡 Abstract:ObjectiveTostudytheinducingapoptosiseffectsofPinelliaternateproteinonhumanhepatomacelllinebel7402.MethodsFloetryeeffects,and0.1mol/LNaCldepositoryproteinform30%(NH4)2SO4depositionalsoshoeeffects.ConclusionThePinel
3、liaternateproteinhassomeeffectsofinducingapoptosisofBel7402,andprobablythetotalorganicacidisthemaininducingapoptosisparts. KeyanhepatomacelllineBel7402;Apoptosis半夏临床上可单独或与其它药物配伍用于治疗食管癌、卵巢癌及肝癌等。近年来对抗癌中药的研究发现,其作用途径主要是通过杀伤癌细胞、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、调节机体免疫功能来实现的[1]。研究也发现,半夏乙醇提取液
4、、半夏总有机酸、掌叶半夏蛋白分别对肝癌细胞(HepG2)、胃癌细胞及卵巢癌细胞具有抑制作用[2~4]。然而不同产地半夏及其类似品所含的蛋白抗癌作用有何差异,目前尚未见相关报道。本文拟采用不同提取方法,观察并比较不同产地的半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用。 1器材与试剂 1.1药物半夏鲜品采自湖北钟祥,经湖北中医学院鉴定教研室鉴定为正品。 1.2试剂与配制DMSO、胰蛋白酶氯霉素、青霉素、EDTA购自Amresco公司;RPMI1640(GIBCO产品);RNase酶、碘化丙啶(PI)均购自Sigma公司;胎牛
5、血清、新生牛血清(三利生物制品厂)。醋酸乙酯、石油醚、95%乙醇等其它均为国产分析纯。 1.3细胞系及培养人肝癌细胞系Bel7402由武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供,用50ml的培养瓶,将人肝癌细胞系(Bel7402)接种于含100u/ml青霉素、0.1g/L链霉素和10%新生牛血清的RPMI1640培养液中,细胞浓度为2×104ml,置于5%CO2,37℃的培养箱中培养。 1.4仪器SHELLRBCO2恒温细胞培养箱;Olympus倒置显微镜;SHZ82A恒温震荡器;无菌操作台(苏州净化设备厂);流式细
6、胞仪(BD公司FACSCalibur型);高速冷冻离心机(上海安亭离心机厂);902型定时恒温磁力搅拌器;LDZX40立式电热压力蒸气灭菌器等。 2方法及结果 2.1半夏蛋白的提取分离新鲜块茎半夏洗净去皮,加入4倍体积0.05mol/LTrisHcl(pH8.0)缓冲液及少量石英砂,高速匀浆后离心(8000r/min,30min),收集上清液,即得粗蛋白。粗蛋白冷却到0℃,逐步加入固体(NH4)2SO4,当饱和度达到30%时,4℃静置2h离心(8000r/min,30min),收集沉淀,得第1个分级沉淀部分。上清液继续加(
7、NH4)2SO4至60%饱和度,4℃静置2h后离心(8000r/min,30min),收集沉淀,得第2个分级沉淀部分。上清液加(NH4)2SO4至90%饱和度,静置无沉淀。将上述2个分级沉淀部分分别用蒸馏水溶解,装入透析袋(透过分子量8000),用蒸馏水在4℃透析脱盐,更换透析液在检测不出(NH4)2SO4为止,把透析袋放入吸水性强的聚乙二醇(PEG,分子量20000)中,浓缩至小体积离心后去除沉淀。将层析柱竖直固定在仪器车上,将DEAESepharoseFF胶装入层析柱中,用0.05mol/LTrisHCl(pH8.0)缓冲液平
8、衡树脂,将30%(NH4)2SO4沉淀部分溶解后以0.5ml/min上柱,分别以0.05mol/LTrisHCl,0.05mol/LNaCl,0.10mol/LNaCl,0.15mol/LNaCl,0.20mol/LNaCl溶液以1
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