rgs1对raw264.7细胞共刺激分子和细胞因

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1、RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因【摘要】目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法:通过克隆RGS1基因、转染RA2000,SuperScript.OneStepRTPCRTaq购自Invitrogen公司。RNATRIzol试剂购自北京鼎国公司。GreatEscAPeTMSEAP购自Clontech公司。TritonX100,羊抗鼠抗体为Sigma公司产品。Trypsin胰酶（Lot:AMG16843）为HyClone公司产品。OPTIMEMI无血清培养基购自Invitrogen公司。PRM

2、I1640购自HyClone公司。类标准胎牛血清购自兰州民海生物公司。G418硫酸盐,硫酸卡那霉素购自Amresco公司。　　1.2方法　　1.2.1克隆RGS1基因测序并建立稳定转染的RAI1640培养基加入100mL/L新生牛血清培养RAEM培养基,颠倒混匀。2μLInvitrogenLipofectaminTM2000溶于50μLOPTIMEM培养基,颠倒混匀后室温孵育5min。混合DNA溶液与LipofectaminTM2000溶液,颠倒混匀后室温孵育20min。吸出24孔板中培养基,加入100μL混合溶液培养8h。加入500μL含血清

3、培养基培养24h。用400mg/L浓度的G418和100mL/L血清培养基筛选培养15d。　　1.2.2检测稳定转染细胞系转染率取4×105稳定转染细胞于流式染色管中1600r/min离心5min,弃上清,加入2mLPBS1600r/min离心5min,弃上清,用1mL(1g/L)多聚甲醛固定细胞。加入2mLPBS1600r/min离心5min,弃上清。加入TritonX100室温静置5min,加入2mLPBS1600r/min离心5min,弃上清。染色:2mLPBS1600r/min,离心5min,弃上清后加入100μLPBS吹散细胞,用1g

4、/L多聚甲醛固定,然后1g/LTriton穿透,加入1μLFITC标记的antiV5抗体,避光放置15min。加入2mLPBS1600r/min离心5min后弃上清,加入100μLPBS吹散细胞,取50μL滴于载玻片上,荧光显微镜观察。　　1.2.3RGS1基因对转录因素活性的影响NFκBseap质粒与RGS1基因共转染RAEM培养基培养RA2000使用说明书方法共转染RGS1基因及NFκBseap质粒。转染36h后每孔收集110μL细胞上清液于0.5mL微量离心管中,12000g离心10s,去除细胞沉淀,吸取100μL上清液于新0.5

5、mL微量离心管,-20℃保存。通过化学发光强度检验（ClontechGreatEscAPeTMSEAP）,利用化学发光分析仪检验化学发光强度,并处理数据。　　1.2.4FCM检测RGS1基因对免疫相关细胞RAL离心管中,1600r/min离心5min,加入5mLPBS冲洗后,1600r/min离心5min,弃上清。离心管中加入700μLPBS缓冲液,平均分入7个预先标记好的流式管中,加入相应抗体后,避光放置15min。每管加入2mLPBS,1600r/min离心5min,洗去未结合抗体,1g/L多聚甲醛固定。FACSCalibur流式细胞仪测定荧

6、光强度,并用FACSort流式细胞仪CellQuest软件分析实验结果。　　1.2.5RGS1基因对免疫相关细胞RA3.1/V5质粒的RA检测RGS1基因转染的RAanalysisofexpressionofsurfacemoleculesbyRGS1transfectedRAoleculesontheRGS1transfectedRAulatedicroarrayanalysisofRGS1transfectedRAW264.7cells　　Note:TRAW264.7:RGS1transfectedRAW264.7cells.　　3讨论　　R

7、GS蛋白控制G蛋白信号转导,加速Gα亚单位的GTP酶活性,与其相关的G蛋白耦联受体也包括部分细胞因子受体,因此靶细胞上RGS的表达可以改变对化学因子的反应性［3］。目前发现RGS1蛋白在淋巴细胞中可以被诱导表达［4］,功能主要包括影响趋化因子诱导的B细胞的移动［5］和树突细胞的移动［6］,并且影响B细胞对细胞趋化因子的反应及增强脱敏作用［3］。我们前期的实验已经证实对癌细胞引导的免疫耐受树突细胞进行基因芯片分析中有多种基因表达的改变,其中包括RGS1基因。本研究中进一步探讨了转染RGS1基因的RA,etal.Regulationofchemota

8、cticandproadhesiceresponsestochemoattractantreceptorsbyRGSfamilymemb