大鼠共刺激分子b7cdna的克隆和骨肉瘤细胞转染

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1、大鼠共刺激分子B7cDNA的克隆和骨肉瘤细胞转染　　摘要:目的为了研究共刺激分子B7增强针对大鼠骨肉瘤的特异性细胞免疫反应，首先需获得大鼠B7分子的cDNA克隆.方法应用反转录PCR的方法，从大鼠脾细胞mRNA中扩增特异性片段.结果经测序表明，所获得的cDNA克隆与已经发表的B7-1和B7-2的cDNA序列完全一致，并将其表达载体转染UMR-106细胞系.结论成功获得大鼠B7共刺激分子的cDNA克隆，其转染的UMR-106大鼠骨肉瘤细胞可用于免疫诱导研究.　　Keyulatorymolecular;osteosara;

2、trans-fection　　Abstract:AIMInordertoevaluatetheeffectofco-stimula-torB7intumorspecificTcellactivation，thecDNAclonesofB7shouldbeobtainedfirst.METHODSThefirststrandofcDNAmRNAofSDratspleen.Thenfragmentsplifiedusingspecificprimersandclonedintoexpressionvector.RESULT

3、STheautomaticsequencingshoorspecificimmuneresponses.　　0引言　　针对肿瘤细胞的免疫应答，除了由T细胞受体（TCR）介导的肿瘤抗原特异性信号的刺激外，还需要B7等共刺激分子的参与才可能诱导出有效的免疫应答［1］.由于B7分子表达水平的降低，导致多种肿瘤在和免疫细胞相互作用时无法提供有效的共刺激信号，这可能是肿瘤发生免疫逃避的机制之一［2］.为了探讨B7分子在骨肉瘤发病中的意义及其潜在的治疗价值，我们应用反转录PCR的方法克隆了大鼠的B7-1和B7-2cDNA.　　1材

4、料和方法　　1.1RNA提取　　取SD大鼠脾脏，用Dako的组织细胞分离器得到单细胞悬液，然后用Promega的总RNA提取试剂盒提取脾细胞总RNA待用.　　1.2PCR引物设计　　根据文献报道的大鼠B7-1和B7-2的cDNA序列［3］，设计两对引物如下:B7-1P1TCATGGCTTACAGTTGCCAGCT，P2GAT-CAAACAGTCTGTTCAGCTG;B7-2P1TCATG-TATGTCGTAAAGACATG，P2GATTACTGCT-GATGCAATTGGG.　　1.3反转录PCR　　首先应用下游引物合

5、成B7-1和B7-2cDNA的第一条链，AMV反转录酶为Promega公司产品，然后取5μL反转录产物按以下条件进行PCR反应:94℃5min启动反应，然后94℃1min，68℃1min，二步PCR共30个循环［4］.反应完成后取5μL电泳，观察产物大小.　　1.4PCR产物的克隆　　将50μL的PCR产物用Gibco的PCR产物纯化试剂盒纯化，然后取10μL用KlenoaI酶切，酶切产物经纯化后用于连接反应.连接反应条件为:PCR产物和载体各4μL，TaKaRa公司T4连接酶1μL，16℃反应4h.　　1.5转化和筛

6、选　　各取5μL连接产物转化常规制备的JM109大肠杆菌，涂氨苄青霉素平板后挑取5个阳性菌落酶切筛选，插入方向正确的载体克隆增菌用于测序.通过奥科公司提供的测序服务获得插入片段的测序结果.　　1.6真核表达载体的转染　　UMR-106大鼠骨肉瘤细胞购自美国ATCC，培养在含100mL・L-1小牛血清的1640培养基中.应用Gibco公司的LIPO-FECTIN将B7-1和B7-2的pMAMneo表达载体转染到UMR-106细胞中，G418筛选出阳性克隆［5］.应用流式细胞仪检测UMR-106细胞B7-1和

7、B7-2分子的表达情况，相应的mAb由日本Juntendo大学Maeda博士惠赠.　　2.3B7cDNA克隆的测序　　测序结果如下（略）.　　2.4B7cDNA表达载体转染骨肉瘤细胞系　　B7-1和B7-2的真核表达载体转染UMR-106骨肉瘤细胞系后经G418筛选获得抗性克隆.　　2.5转染细胞系的B7分子表达　　用流式细胞仪检测转染细胞系UMR71T和UMR72T相应的B7分子表达，结果发现B7-1和B7-2分子的表达分别提高了41%和27%.　　3讨论　　越来越多的证据表明，人类肿瘤免疫原性低下的可能原因之一在于

8、缺乏共刺激分子的表达，在很多情况下，单有肿瘤抗原特别是弱的肿瘤抗原尚不能有效地刺激机体产生免疫反应，它们往往被免疫系统所忽略，此时需要有共刺激分子提供的第二信号的参与.在过去十年间所发现的共刺激分子中，B7-1和B7-2在诱发机体抗肿瘤免疫中的作用受到广泛重视，经转染B7基因的黑色素瘤细胞能诱导机体产生肿瘤排斥反应［6］，在不表达