mig14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

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1、mig14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节【关键词】伤寒沙门菌；mig14；高渗应激；基因芯片分析［Abstract］Objective:Toexplorethefunctionofmig14ofSalmonellaentericaserovarTyphiinresponsetohyperosmoticstress.Methods：Amig14genedeletedmutantofS.entericaserovarTyphiologousrebinationmethodbymeansofasuicideplasmid

2、;thedifferenceofthegeneexpressionbetig14mutantatearlystageofhyperosmoticstressicmicroarrayassayandpartiallyconfirmedbyrealtimequantityreversetranscriptionPCR.Results：Successfullyconstructedamig14mutant;about77and72genesoticstressinmig14mutant.Conclusion：mig14maybe

3、aregulator,mayprimallyregulatethesubstancemetabolismandenergymetabolismofSalmonellaenterica.［KeyonellaentericaserovarTyphi;mig14;hyperosmoticstress;DNAmicroarrays原核生物的信号转导可由膜蛋白和胞内的效应调节蛋白构成的双组分调控系统执行。PhoP/PhoQ是许多革兰阴性菌都有的一个重要的双组分调节系统，在低镁或酸性条件下，膜上的PhoQ被激活发生磷酸化，后者再特异性地作用于

4、胞内的PhoP，使其磷酸化激活［1］。磷酸化的PhoP可激活slyA,mig14等基因，这些基因与细菌耐受酸性环境有关［2,3］。Brodsky等［2］已经证明mig14能介导伤寒沙门菌抵抗多种抗菌肽的杀伤作用，但机制目前还不清楚。从基因序列分析发现，mig14与DNA调节性蛋白基因有较小的同源性，提示它也可能是一种调节蛋白。有研究表明,在沙门菌高渗应激早期mig14基因表达量明显增高［4］，因此怀疑mig14在沙门菌耐受高盐渗透压环境中可能发挥着重要作用。本研究拟用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig14基因

5、缺陷变异株，并通过用全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和mig14缺陷株在高渗应激早期的基因表达谱差异，以分析高渗应激条件下mig14在伤寒沙门菌中的作用。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株和质粒伤寒沙门菌野生株GIFU10007，大肠埃希菌SPY372λpir,大肠埃希菌DH5α，pMD18T载体，自杀质粒pGMB151。1.1.2引物根据NCBI公布的伤寒沙门菌Ty2基因序列信息，在mig14基因上游和下游设计两对特异性PCR引物：P1A/P1B和P2A/P2B，P1A和P2B含BamHⅠ酶切位点，P1B和P2

6、A含BglⅡ酶切位点。设计的上游片段F1长459bp，下游片段F2长857bp。根据treC，cydA，pagP和invF基因序列设计实时荧光定量RTPCR(qRTPCR)引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。表1引物序列表1.1.3主要试剂限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ，T4DNA连接酶，碱性磷酸酶，ExTaq，dNTP，RNaseH，XGal，DL2000和λHindⅢdigest分子质量标准以及TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；质粒提取试剂盒（Axygen公司）；胶回收试剂盒（P

7、romega公司）；IPTG（Sigma公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（Oxoid公司）；RNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒（Qiagen公司）；反转录试剂盒（Invitrogen公司）。1.1.4主要仪器PCR仪（MastercyclerPersonal，Eppendorf），高速冷冻离心机（Megafuge，HERAEUS），凝胶成像及分析系统（Syngene，Gene），核酸检测仪（BioPhotometer，Eppendorf），电穿孔仪（BioRad），电热恒温干燥箱（Ecocell），核酸杂交仪（RollerBlo

8、tHB3D,Techne），基因芯片扫描仪（GenePix4100A，Axon）。1.2方法与步骤1.2.1制备伤寒沙门菌mig14缺陷株伤寒沙门菌mig14缺陷株的制备参考文献［5］进行，分别用引物P1A/P1B和P2A/P2