osmy对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达调节作用

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1、江苏大学硕士学位论文OsmY对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达调节作用姓名：孟彦辰申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：黄新祥20120608江苏大学硕士学位论文摘要目的：osmY是伤寒沙门茵中的一个周质蛋白，在许多肠道菌环境高渗应激后都会有明显的表达增加，且有迹象表明sigma因子I印oE和RpoS均可调控其表达，提示其在肠道菌应答环境高渗应激反应中具有重要作用，因此本研究拟进一步研究伤寒沙门菌中OsmY在高渗应激早期对系统基因表达的影响及作用。方法：1．伤寒沙门菌傩朋】，缺陷变异株的制备：采用自杀质粒介导的同源重组方法制备目

2、的基因缺陷变异株。根据目的基因序列设计特异性引物来扩增上下游同源片段，定向连接，酶切后插入自杀质粒pGMBl5l中，将筛选出的阳性质粒经电击转入伤寒沙门菌野生菌，进行同源重组筛选含目的片段的菌株，最后经序列分析鉴定。2．傩所】，基因缺陷回补株的构建：以伤寒沙门菌基因组DNA为模板PCR扩增回补目的基因，酶切后与表达载体pBAD鹰III定向连接，将筛选出含目的片段的质粒热击转化到大肠埃希菌DH50【中筛选阳性质粒，经序列分析鉴定后，转入相应的傩m】，基因缺陷变异株中，同时将pBAD空载体热击导入嗍】，基因缺陷变异株中作为对照菌株。OsmY

3、对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达调节作用3．生长曲线的测定：以生长时间为横坐标，细菌oD600值为纵坐标，绘制在高渗的条件下，野生株与缺陷株生长曲线。4．动力试验分析：在高渗的半固体培养基上观察野生株、傩m】，缺陷变异株的动力情况。5．伤寒沙门菌基因表达谱分析：利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株与∞m】，基因缺陷变异株在高渗应激的条件下表达谱差异。体外模拟高渗环境应激，在低渗(50咖ol／LNaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和删y基因缺陷变异株4h(37℃，250r／min)至对数生长期，后转入高渗(3

4、00mm01／LNaCl)LB培养液中以同样条件继续培养，在高渗应激早期(30min)，分别提取伤寒沙门菌野生株和∞优】，基因缺陷变异株的总砒蛆，反转录成cDNA并配对标记荧光(cy3或cy5)，与基因组芯片杂交，扫描后根据综合荧光信号分析各基因转录表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和伽，，ly基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。6．实时荧光定量PCR(qI汀．PCR)分析：为了验证DNA芯片结果，选择不同操纵子的部分基因芯片差异明显的基因，设计特异性引物进行实时定量PCR。结果：1．经PCR及序列分析证实，变异株中傩所y基因编码

5、区缺失了366个碱基，表明成功构建伤寒沙门菌伽m】，基因缺陷变异株。2．PCR及序列分析结果表明，成功构建pBAD．∞朋y阳性重组载体，已将阳性载体及空载体分别热击导入相应的缺陷株中。n江苏大学硕士学位论文3．生长曲线结果表明伤寒沙门菌绷】，基因缺陷变异株在高渗条件下生存能力与野生株无明显的差异。4．动力试验结果显示，在高渗的情况下，傩所y基因缺陷株动力相比野生株明显下降。5．基因芯片分析结果显示，在高渗应激条件下，伤寒沙门菌∞朋】，基因缺陷变异株与野生株相比，表达谱出现了明显的变化。有27个基因表达上调，128个基因表达下调，主要涉及

6、渗透压相关基因，调节蛋白基因，Vi荚膜基因，菌毛基因，核蛋白体基因及酶类相关基因等。6．实时荧光定量PCR结果与基因芯片分析结果基本一致，证明了基因芯片结果的可靠性。结论：伤寒沙门菌中．OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用，对动力及多种代谢因子具有调节作用。关键词：伤寒沙门菌：嗍y：高渗应激；基因芯片；基因表达调节。Hl江苏大学硕士学位论文ObjectiVe：ABSTRACTOsmYisap撕plasmicproteinin勋砌D以砒绷胁semver聊hi@Typh瑰锄d廿leexprcssionof

7、OsmYisincreasedinsomeofenterobacteriaaRereIWTiomentalhyperosmotics仃ess．PreviousresearChesshowedthattheeXpressionofOsmYisco．regulatedbysi肿afactorsRpoEandRpoS．IIl“sstudy，wewillinvestigatethefhnctionofOsmYongeneexpressionregulati伽of&1卯hiatearlystageofhyperosmoticstress．Meth

8、ods：1．Theconstructionof口sJ”】，deletedmutants．’Ihetar苫etgenedeletedmutantof&Typhj、张spr印aredbyhomologousre