全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断

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1、全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断植入前遗传学诊断(preimplantationgeicdiagnosis，PGD)是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇，从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查，通过分析选择正常的胚胎移植，可以防止遗传学异常妊娠的发生，将产前诊断提前到胚胎植入子宫内膜之前。避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。但由于可用于PGD分析的材料为胚胎中取出的个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞，这些材料十分有限，所以在进行PGD之前，需对单细胞进行全基因组扩增(eampliflication，DA应用于PG

2、D的情况，分析了MDA方法的优势与不足。1引言伴随着人类辅助生殖技术的发展，特别是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及单精子胞浆内显微注射(ICSI)的广泛应用，使得越来越多的不育患者实现了生育下一代的愿望，但随之而来的遗传病的患病风险也明显增加[1]，而胚胎植入前遗传学诊断却能有效地降低后代患遗传病的风险，故胚胎植入前遗传学诊断将成为临床检验的重要手段。胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇，从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查，通过分析选择正常的胚胎移植，可以防止遗传学异常妊娠的发生，将产前诊断提

3、前到胚胎植入子宫内膜之前。该技术包括体外受精胚胎移植(invitrofertilizatio-andembryotransfer，IVF-ET)的临床手段，聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybriddization，FISH)等检测技术。全基因组扩增(eamplification，DA)。2.1PEP和DOP-PCR技术引物延伸预扩增(Primerextensionpreamplification，PEP)用到的是PCR技术、Taq酶和由15个碱基的随机寡聚核苷酸组合出415种不同序列的引物，其变性后在37℃条件下低温退火，然后缓慢升

4、至55℃延伸，随机扩增基因组DNA，扩增产物覆盖接近基因组96%区域，同时放大1000倍[3]，PEP后续采用巢式PCR或以其终产物为模板，使用特异的引物序列进行扩增，从而到达检测的目的。普通PEP的总反应时间需经历14h，其较长时间的反应周期阻碍了其在临床PGD检测中的应用。在改善普通PEP的反应体系以及热循环条件后，其反应时间缩短至5.5h[4]，虽然反应时间缩短，但改良后的PEP仍然保持着原有扩增效率，甚至提高了扩增的特异性，其命名为改良的引物延伸反应预扩增(improve-PEP，I-PEP)。2003年Jiao等[5]应用PEP结合巢式PCR技术及反向点杂交技术(RDB

5、)的方案，对β-地中海贫血携带者行PGD，成功出生了健康的小孩。然而，普通PEP扩增产物的长度达不到1500bp，较低的扩增率、产生片段的过短成为PEP技术在PGD中广泛应用的最主要障碍。另一种DA)技术MDA技术是目前最受关注的DA是一种基于链置换和环状滚动扩增的全基因组扩增技术。该技术利用一种φ29DNA聚合酶催化六聚体随机引物对基因组进行扩增，其反应条件为在30℃下恒温。扩增时，六聚体随机引物在多个位点与模板DNA退火，在φ29DNA聚合酶的作用下同时启动复制。引物沿着模板链延长，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又作为新的模板完成一次扩增，经过长时间的循环，最终经过65

6、℃灭活可获得大量的DNA。该技术适用于各种样本，低DNA含量的样本，尤其是在临床应用中常出现的单细胞取材，如单个淋巴细胞、单个精子、单个滋养层细胞或卵裂球等。也可直接从新鲜或干燥的全血、白膜层和培养的细胞等进行扩增，也可是石蜡包埋的样品，但效果较差[8]。在临床应用中，MDA表现出高扩增效率和精确性，相较于以PCR基础的DA表现出显著的优势。2009年Ren等[9]通过MDA技术扩增单细胞基因组DNA完成两家DMD临床PGD实验，每个家系均分析了一个DMD基因的突变位点和6个STR连锁标记，最后各出生一个健康的女孩。2010年Eduardo等[10]用MDA技术结合PCR-连锁分

7、析完成了1家PKHD1家系的临床PCR实验，他们共分析了20个PKHD1基因及其侧翼序列中的STR位点，最终出生了一个健康孩子。2.2.1MDA技术的优点首先是其持续合成能力，MDA方法比以PCR为基础的扩增方法扩增效率更高，可将微量模版扩大数千倍以上。φ29DNA聚合酶的合成力极强且持续时间长，产物片段平均长度可大于10kb。而在PCR反应中，反复的变性和退火约40个循环左右，DNA扩增即进入平台期，MDA因为其反应全程恒温，其酶活性能持续长达16小时，从而可产生足够量的DNA