G6PD缺乏症胚胎植入前遗传学诊断体系的建立

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1、汕头大学医学院硕士学位论文硕士学位论文题目G6PD缺乏症胚胎植入前遗传学诊断体系的建立Establishapreimplantationgenetic英文题目diagnosissystemforG6PDdeficiency姓名吴彤华学号SZ13039所在学院汕头大学医学院导师姓名蔡应木专业临床检验诊断学入学日期2013年9月答辩日期2015年5月I万方数据汕头大学医学院硕士学位论文学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以

2、明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日I万方数据汕头大学医学院硕士学位论文中文摘要研究背景植入前遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis,PGD

3、）是在胚胎植入子宫前进行的最早期的产前遗传学诊断，是杜绝致病基因垂直传播的最有效方法。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD）缺乏症，是世界上最常见的酶缺陷病之一，为X连锁不完全显性遗传。临床表现具有高度异质性，主要表现为溶血性贫血和以未结合胆红素升高为特点的高胆红素血症。成年患者最严重的威胁是出现急性肾衰竭，而新生儿期发病则可导致核黄疸，造成永久性神经系统损伤甚至死亡。该病是联合国卫生组织6种主要应该预防和控制的遗传病之一，亦是广东省及深圳市出生缺陷干预工程的干预病种之一。目前国内外主要通过性别选择避免有表型的胚胎移植，尚无针对

4、G6PD基因PGD的报道。简单的性别选择并不适用于所有G6PD缺乏症夫妇，只有通过针对性的G6PD基因的检测才能最有效地阻断该基因的垂直传播，达到优生目的。故建立G6PD基因PGD诊断意义深远。研究目的（1）应用巢式PCR联合多重SNaPshot技术，建立稳定、快速、准确的单细胞G6PD基因诊断方法，并评估巢式PCR法在G6PD缺乏症PGD中的可行性。（2）应用全基因组扩增（wholegenomeamplification,WGA）技术，联合多重SNaPshot微测序和单倍型分析，建立可监测污染和等位基因脱扣（alleledropout,ADO）发生与否的单细胞G6PD基因诊断体系，并评估

5、该体系在G6PD缺乏症PGD中的可行性。I万方数据汕头大学医学院硕士学位论文研究方法（1）获取单淋巴细胞，应用巢式PCR结合多重SNaPshot技术建立对G6PD基因突变高发的Exon2、9、11、12四个外显子上的12个突变位点的单细胞基因诊断方法。（2）分别获取单淋细胞、单卵裂球及滋养层细胞，在WGA技术基础上应用多重SNaPshot技术检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点，并联合Xq28上6个短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）位点的单倍型分析技术及Amelogenin基因的性别诊断技术建立G6PD缺乏症PGD诊断体系。研究结果（1）应用多重巢式PC

6、R结合SNaPshot技术在单细胞水平上成功建立检测Exon2、Exon9、Exon11、Exon12上12个G6PD突变位点的基因诊断方法，检测58个正常和108个杂合子单淋巴细胞，扩增效率为90.97%，ADO率为8.08%。（2）联合应用WGA技术、SNaPshot基因分型技术、单倍型分析技术和性别诊断技术，在单细胞水平上成功建立既可扩增所有能发生突变的外显子，检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点，又能同时监测污染或ADO的诊断体系。检测60个正常和96个杂合子单淋巴细胞，WGA扩增效率为94.23%；成功扩增的WGA产物在后续基因检测的总扩增效率为89.37%，总的ADO

7、率为13.74%，各项基因间的扩增效率和ADO率有统计差异（P<0.05）。检测24个单卵裂球，WGA扩增效率为95.83%；成功扩增WGA产物在后续基因检测的总扩增效率为92.39%，总的ADO率为10.00%，各项基因间的扩增效率无统计差异（P>0.05）。活检8个囊胚的滋养层细胞，WGA均扩增成功，后续实验中亦未见基因扩增失败，滋养层细胞的检测结果均与对应的囊胚阳性对照一致，未见ADO发生。（3）比较所建立的两种方