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时间:2018-10-28
《丙型肝炎病毒不同片段抗体蛋白芯片的制备及评价 》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、丙型肝炎病毒不同片段抗体蛋白芯片的制备及评价何谦,楚雍烈,林联成,王香玲,刘余静【关键词】肝炎病毒PreparationandevaluationofproteinchipfordifferentHCVantibodydetection 【Abstract】AIM:ToprepareandevaluatetheclinicalapplicationofproteinchipfordifferenthepatitisvirusC(HCV)antibodies.METHODS:ProteinchipfordifferentH
2、CVantibodiesericantigenandthe4segmentsofHCVantigensontheslide.TheresultsofthismethodericantigenaccordedetoRIBA,theaccordancerateentsofHCVantigensa公司);不同片段抗体标准品由深圳赛尔生物技术有限公司惠赠;RIBA3.0试剂,载玻片(美国Chiron公司);抗HCV(ELISA)试剂(上海永华细胞和基因高技术分析中心);血清标本99例,均来源于西安交通大学第一医院和第二医院门诊及住
3、院患者. 1.2方法 1.2.1包被和封闭将融合抗原及各片段抗原配成不同浓度,用点样仪将其点样于醛基化玻片上,37℃温浴2h后晾干.用含100mL/L小牛血清的PBS(0.01mmol/LPBS,pH7.2)37℃封闭2h,晾干放于4℃冰箱过夜后备用. 1.2.2检测取出制备好的芯片,加1∶10倍稀释血清10μL,37℃水浴30min,PBST(0.01mmol/LPBS,pH7.2,0.5mL/LTin,PBST洗涤5次后,用ScanArray4000B扫描仪扫描. 1.2.3结果判断不同片段中有一个阳性判为可疑
4、,两个或以上片段阳性则判为阳性标本. 统计学处理:方法准确性判断采用Youden指数,方法一致性判断采用Kappa值. 2结果 2.1实验条件选择用棋盘滴定法进行抗原浓度、样品稀释倍数及CY3抗人IgG结合物浓度的确定.不同浓度的各片段抗原点样,测试标准品并与RIBA试剂比较,符合率最高者为点样浓度.结果以融合抗原100μg/L,C区抗原100μg/L,NS4抗原50μg/L,NS5抗原50μg/L为最佳.样品稀释倍数以1∶10为宜.CY3抗人IgG结合物浓度测定以1∶500为最佳浓度. 2.2重复性和稳定性试验将
5、上述包被好的蛋白芯片分别置于4℃冰箱和室温下贮存7d和1,3,6mo后取出,用上述方法分别检测20例阳性标本和正常对照,结果与新鲜包被的蛋白芯片一致. 2.3特异性试验取甲肝抗体阳性、乙肝表面抗体阳性、巨细胞病毒抗体阳性、类风湿因子阳性血清各20份,用本试剂检测,结果均为阴性. 2.4不同丙肝抗原片段Cutoff值(S/n)的确定检测407例正常人血清,计算每种抗原的平均荧光强度,求得信噪比.各片段阴性对照的信噪比应小于2.5.Cutoff值等于各片段阴性对照平均值加3倍标准差,片段信噪比大于Cutoff值时该片段抗体
6、为阳性(Tab1).表1不同丙肝抗原片段的均值、标准差和Cutoff值(略) 2.5考核评估蛋白芯片各片段检测与RIBA确证试剂进行比较,结果见Tab2.表2HCV蛋白芯片与RIBA各区段抗体检出比较(略) 2.6抗HCV(ELISA)试剂和蛋白芯片法的比较抗HCV(ELISA)试剂检测样本99例,其中阳性标本69例,阴性30例.30例抗HCVELISA试剂检出的阴性样本,蛋白质芯片的融合抗原检测均为阴性,蛋白质芯片的分片段检测均为阴性;69例抗HCVELISA试剂检出的阳性样本,蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例
7、,阴性2例;蛋白芯片分片段检测根据不同片段中有1个阳性判为可疑,2个或2个以上阳性则判为阳性标本的判定标准,蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例,阴性1例,可疑标本1例.统计学分析表明,蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比,阴性符合率为93.8%,阳性符合率为97.1%,具有较好的一致性(Kappa值=0.953,P0.05).蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比,阴性符合率为96.8%,阳性符合率为97.1%,具有较好的一致性(Kappa值=0.954,P0.05). 2.7RIBA试剂和蛋白芯片法的比较RIBA
8、试剂检测样本99例,其中阳性标本66例,阴性31例,可疑标本2例.蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例,阴性32例.蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例,阴性31例,可疑标本1例.统计学分析表明,蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比,阴性符合率为96.9%,阳性符合率为98.5%.具有较好的一致性(
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