tat融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

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1、TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫王宪锋，刘忠湘，李淑梅，缪军【关键词】恶性疟原虫IntracellulardeliveryofTATfusionproteinintoerythrocytestagePlasmodiumfalciparum　　【Abstract】AIM:ToinvestigatethetransductionofTATp53fusionproteinintoerythrocytestagePlasmodiumfalciparum(P.f).METHODS:PurifiedTATp53proteinandp53proteinalarialparasiteculturefor30

2、min.Thebloodsmearmunofluorescenceassayaftertransduction.TheeffectofTATp53onthegroinedbycountingtheparasitemiachangesbetiaofP.fculturetreatedalarialparasite.　　【Keyodiumfalciparum;TATp53;proteintransduction　　【摘要】目的：探讨TATp53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性.方法：将纯化的TATp53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30min后，制备血涂片，利用间接免疫荧光方法检测

3、融合蛋白的转导.同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12h前后的感染率变化，观察蛋白转导对疟原虫生长的影响.结果：TATp53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜，进入虫体细胞内，并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体，而p53蛋白不能进入疟原虫内.融合蛋白与疟原虫共孵育12h后其感染率与对照组之间无显著差异（P>0.05），说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响.结论：TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内，这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.　　【关键词】恶性疟原虫；TATp53融合蛋白；蛋白转导　　0引言　　目前疟原虫基因功能研究技术，包括基因敲除，基因置换，基

4、因座位置换，外源基因的表达以及最近建立的疟原虫四环素诱导性转基因表达系统等方法都是建立在基因转染技术的基础上〔1-3〕，而疟原虫基因转染效率的极度低下〔2,4〕成为疟原虫转染尤其是稳定转染研究中一个瓶颈因素，到目前为止这方面研究仍然没有突破性的进展.人类免疫缺陷病毒I(humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)TAT(transactivatortranscription)蛋白的蛋白功能区，即蛋白转导结构域（proteintransductiondomain，PTD）〔5〕，能够有效的引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能.我们即将TATp53融合蛋白与红

5、内期恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum，P.f)进行共孵育，观察融合蛋白是否能通过疟原虫的多层细胞膜转导入虫体，以期为疟原虫基因功能的研究引入一种新的技术手段.　　1材料和方法　　1.1材料　　恶性疟原虫D10株由德国海德堡大学Dr.MichaelLanzer赠送，参照刘忠湘等〔6〕的方法进行培养.O+红细胞来自本实验室志愿者，离心去除白细胞后用于疟原虫培养.纯化的TATp53融合蛋白，p53蛋白，抗p53小鼠血清和抗AMAMSP小鼠血清为本实验室制备.PBS(10×储存液,Na2HPO4・12H2O40g,KH2PO45g,NaCl81g,200g/LNaN31mL,pH7

6、.2)，羊抗鼠免疫球蛋白为美国Sigma产品.　　1.2方法　　1.2.1蛋白转导未经同步化的恶性疟原虫培养物用于转导试验.96孔板中每孔接种200μL培养原虫，然后加入纯化的TATp5315μL或p53蛋白，轻缓混匀后置于37℃细胞培养箱中继续培养30min.将蛋白虫体混合物完全转移至1.5mL离心管中，加入PBS于6000r/min离心7s,弃上清，用沉积的虫体细胞涂制原虫亚厚血涂片用于间接免疫荧光分析.　　1.2.2间接免疫荧光分析涂制的疟原虫血涂片浸入预冷的丙酮溶液中固定5min，空气自然干燥.为限定反应范围，每张涂片中用蜡笔画3个圆圈，每个圆圈中加入200μL用5g/LBSAPBS稀

7、释(1∶100)的抗p53或AMAMSP小鼠血清，放入湿盒中作用30min后再浸入PBS于微型振荡器上振动洗涤3×5min.然后于每个圆圈中加入200μL以FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白（PBS1∶76稀释），于室温作用30min，同上振动洗涤3×5min.滴加500mg/L甘油封片后荧光显微镜下观察.　　1.2.3蛋白转导对疟原虫的影响实验中将同一份培养原虫分为3组，即对照组，TATp53处理组