vegfr3胞外区基因真核表达载体的构建

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1、VEGFR3胞外区基因真核表达载体的构建【】目的构建vegfr3胞外区基因真核表达载体pcdna3.1vr3，并在体外进行表达和鉴定。方法采用rtpcr技术，扩增c57bl/6小鼠胚胎vegfr3胞外区cdna片段，通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcdna3.1，构建重组质粒pcdna3.1vr3。经限制性酶切鉴定和dna序列测定结果证实后，将重组质粒经脂质体法转染cos7细胞,aingenechenyan,ingmedicalcollege，tumorinstituteofyunnantumorhospit

2、al,kunming650118,chinacorrespondingauthor:ail:aingene.theexpressionandidentificationofthevectorethodstheextracellulardomainofvegfr3encodingsequenceplifiedbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionfromc57bl/6miceembryoandclonedintothehindⅲxbaⅰsitesofpcdna3.1.afterc

3、onfirmedbysequencingtherebinantplasmidpcdna3.1vr3ainsofvegfr3encodingsequencec57bl/6miceembryo.andthepcdna3.1vr3eukaryoticexpressionvectoraypaveaalsexperiment.keyphangiogenesis;eukaryoticexpression淋巴转移是恶性肿瘤转移的一个重要途径。.133229.有无淋巴结转移及转移淋巴结的数目一直被认为是决定肿瘤患者临床分期、治疗方案制订和预

4、后评估的重要因素之一。血管内皮细胞生长因子受体3(vascularendothelialgroega公司；trizol试剂、lipofectamine试剂购自invitrogen公司；rtpcr试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自qiagen公司；dl2000分子量标准、dna连接酶试剂盒购自takara公司；generulertmdna分子量标准为bbi公司产品；羊抗鼠vegfr3抗体购自abcam公司；兔抗羊igg购自chemicon公司；proteindetectertmelisa试剂盒购自kpl公司；硝酸纤维素膜、e

5、cl显色试剂盒购自biosciences公司。pcr仪为mjresearch公司产品，凝胶成像系统为syngene公司产品，电泳仪为biorad公司产品，低温高速离心机购于heraeus公司，二氧化碳培养箱、生物安全柜、超低温冰箱均为forma公司产品。1.3重组质粒pcdna3.1vr3的构建使用trizol试剂提取总rna。核酸蛋白定量仪(biorad)测定rna纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测总rna完整性。以genebankvegfr3（gi6679812）胞外区cdna序列为目的基因，使用primerpremier5.

6、00引物设计软件，设计如下引物，p1的5′端所带限制性酶切位点为hindⅲ，p2的5′端所带限制性酶切位点为xbaⅰ：上游引物p1：5′aagcttgccaccatgggttactccatgacccctc3′下游引物p2：5′gctctagattaactccatgctgcctttatc3′rtpcr扩增目的片段，扩增条件：50℃逆转录30min，95℃灭活逆转录酶和预变性15min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸2min，38个循环后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳，以确定反应产物大小是否为所需目的

7、片段。hindⅲ和xbaⅰ双酶切目的片段与pcdna3.1，回收纯化后进行dna连接反应。连接产物转化大肠杆菌dh5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取阳性单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养至对数生长后期；提取重组质粒dna，hindⅲ和xbaⅰ酶切鉴定后，送beckmon公司测序证实。1.4重组质粒转染细胞以及表达产物的鉴定将处于对数期的cos7细胞接种于细胞培养瓶和6孔培养板，加入重组质粒pcdna3.1vr3与脂质体混合物。置co2培养箱中培养6h后，吸出培养液，

8、加入新鲜的dmem培养液继续培养48h。用0.25%胰酶消化cos7细胞，收集转染细胞，进行arker（dl2000）;2:rtpcrproduct图1rtpcr扩增产物电泳fig1agarosegelelectr