assayprotocol(细胞培养试验流程)

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1、AssayProtocol细胞培养一、仪器、试剂仪器：细胞培养瓶，移液枪，枪头盒（5ml、1ml、lOOgl、10（il）,移液管（5ml、10ml）,玻璃分装瓶（100ml、200ml>500ml）,高压铝盒（离心管、冻存管），离心机（800转5min），倒置显微镜，细胞计数板，水浴箱（37°C）,CO2培养箱（调整至37°C、5%CO2）。试剂：DMEM,Serum,Trypsin,P.S.，Puromycin，DMSO。二、试剂配制10mlCompleteMedia：DMEM9ml；Serumlml；P.s.lOOgl

2、.10mlFrozenMedia：CompleteMedia8ml；Serumlml；DMSOlml。Puromycin（2

3、ig/（il）:6（ilPromycin/4mlCM三、具体操作1.准备：取各种己消毒的培养用品（枪头盒、高压铝盒、分装瓶）置于净化台面，紫外线消毒30分钟，Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin从4°C冷藏拿出至室温待用（使用之前用75%酒精全面消毒）。开始工作前先洗手、戴上乳胶手套，用75%酒精喷拭手至肘部。紫外灭菌时间到后，将灯和风机打开，开始工作。将Media、T

4、rypsin、Serum、P.S.、Puromycin去除封口处密封条，用75%酒精喷拭全面消毒后拿进去待用（注意：使用之前，应充分摇匀）。合理摆放所需物品，尽景减少手部的大幅度摆动，点燃酒精灯，配置100mlCompleteMedia:用10ml移液管吸取DMEM10ml*9次至分装瓶中，再吸取Serum10ml至分装瓶中，再加入1mlP.S.用移液管吹打混后待用。1.辛将待处理细胞取出后，倒掉原存的培养基；安装5ml移液枪头后吸取PBS5ml，每支细胞加入2.5ml,清洗细胞代谢物和培养瓶底部（清洗不干净会使胰酶消化变难

5、），清洗过后倒掉PBS（垂直倾斜瓶各倒一次，一定要倒干净，防止残余PBS稀释Trypsin，影响酶解效果）。然后，每支细胞加入0.5tnlTrypsin，摇摆培养瓶使其充分覆盖瓶底，待每一支培养瓶都加入Trypsin摇匀后，再从第一支开始，用力拍打培养瓶，左右摇摆使细胞都被消化下来，不在贴壁，依次拍打各支细胞，观察，使其全部都消化完全（注意：控制消化时间不要太久，把握不好就要再显微镜下观察）。然后再加入3倍体积的Media1.5ml于培养瓶中，终止其消化。再确保枪尖无污染的前提下，同一种细胞可以用同一个枪头来吹打细胞（仔细吹

6、打培养瓶，尤其是边边角角），使其成为单细胞悬液。2.提前用镊子准备出4ml离心管，对应每一支细胞，做好标记。再细胞吹打完全后，用移液枪将细胞悬液转移至离心管中，用密封条封好U。待所存细胞都转移至离心管后，①将待冻存的细胞放置于准备好的碎冰中保存待用（合理放置防止染菌）；②将用于分瓶传代的细胞先800转离心5min（离心过程中，每一支培养瓶中加入3.5mlMedia）后取出，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密封），打开瓶盖后烧瓶口灭菌，小心倒掉上清后烧瓶口灭菌，然后加入1ml或1.5mlMedia吹打均匀（注意：不要产生大量气泡

7、）后，对应各自的培养瓶，均匀的进行一分二或一分三传代，摇晃均匀，观察后，放入002培养箱中继续培养。1.将①等待冻存的细胞悬液，进行800转离心5min。在此期间，配制冻存液ep:10ml，可在用完的serum15ml离心管中，加入8mlMedia，lmlserum,lmlDMSO,吹打混匀后待用；然后用镊子取出对应的n支冻存管，做好标记（名称、日期、作者姓名首字母缩写）。离心结束后，取出离心管，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密封），打开瓶盖后烧瓶口灭菌，小心倒掉上清后，烧瓶口灭菌，然后加入2ml配好的冻存液，吹打均匀后，进

8、行1分2的冻存，待所有细胞处理完全后，先至于-20°C中等待，然后转移至-80°C冰箱中保存，并做好冻存记录注意事项:1、严格无菌操作，打幵/拧上瓶盖时一定要烧瓶口灭2.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%洒精擦拭瓶子的外表面，并靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌。2.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。3.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。4.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。四、细胞的冻存（补充）1.

9、先将冻存管放入4QC冰箱，约40min。2.接着置于-20°C冰箱，约30-60min。3.置于-80超低温冰箱（可保存半年）中放置过夜。4.置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。6.不宜将冻存细胞放置在0°C〜-60°C这一温度范围内过久，低温损