纤粘连蛋白在大鼠牙周炎牙龈组织中的表达

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1、纤粘连蛋白在大鼠牙周炎牙龈组织中的表达　　前言　　　　纤粘连蛋白(fibronectin,FN)是一种重要的细胞外基质成分之一，为具有高度粘附活性的糖蛋白，广泛弥漫地表达于人和多种动物健康牙龈结缔组织基质内。随着个体年龄的增长，FN在结合上皮基底面下形成线形染色，此染色线随着结合上皮根向迁移的不断延伸而不断延长，推测牙龈结合上皮根向迁移与FN有关。FN在非健康牙周组织内的表达形式、部位和强度因牙周疾病性质的不同而存在着明显的差异，其影响机制及其在疾病发生发展中的作用尚缺乏系统研究。　　本实验拟通过

2、动物实验方法、免疫组化技术和光镜手段，观察FN在大鼠牙周炎牙龈组织中的表达，探讨其在牙周组织炎性破坏及结合上皮根向迁移中的作用。　　1材料与方法　　　　1.1材料　　26只8周龄雄性3/3）]，牙体无缺损及畸形，牙周无发育异常及炎症。随机分为局部丝线结扎高糖软食4周组和局部丝线结扎高糖软食8周组两大组；每一小组大鼠13只，其中施以实验因素10只，空白对照3只。　　1.2方法　　1.2.1大鼠牙周炎实验模型的建立1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉实验组大鼠，3/0丝线于双侧上颌第二磨牙牙颈部龈缘水平结扎，并

3、沿根尖方向压入龈沟内（以不损伤结合上皮为原则）。定期检查丝线结扎情况。实验组大鼠配以高糖软食（100g/L高糖水代替饮水，常规鼠料浸泡成软食代替颗粒饲料）。对照组大鼠饮水及饲料正常。　　1.2.2牙周组织标本制备按实验设计，颈椎脱位法分组处死实验动物，解剖分离出双侧磨牙区牙体-牙周联合组织块，10%中性福尔马林液常温下固定24小时，10%EDTA液微波脱钙3-4周，常规石蜡包埋，近远中向连续切片。每个组织块，选择颊舌向中点处组织切片10张，每组5张。　　1.2.3FN免疫组织化学染色片厚0.5-1

4、μm。用APES处理过的载玻片捞片，烤片；脱蜡、脱苯；蒸馏水水洗2遍，3%H2O2阻断10分钟，蒸馏水水洗2遍；滴加胃蛋白酶，37℃温箱内孵育20分钟；PBS漂洗3次（每次5分钟），滴加兔抗鼠FN多克隆抗体稀释液4℃过夜；吹掉一抗，PBS漂洗3次（每次5分钟），滴加二抗工作液，置保湿盒内20分钟；吹掉二抗，PBS漂洗3次（每次5分钟），DAB显色，光镜下控制显色时间；流水冲洗3-5分钟；苏木素复染；脱水、透明，中性树胶封固，烘片。光镜下观察，MoticMed6.0数码医学图像分析系统摄片。　

5、　2结果　　2.1对照组FN的表达　　结合上皮根方附着于釉牙骨质界之牙骨质端。胶原纤维束边缘清晰，染色均匀，排列规则有序。FN阳性表达为棕黄色颗粒，定位于牙龈固有层和牙周膜血管内。FN相对均匀弥漫表达于整个牙龈固有层结缔组织基质内；在结合上皮基底面，FN粗线形密集表达；在沟内上皮下毛细血管密集区毛细血管周围基质内FN凝集纤维X样表达，（图1）。　　2.2牙周炎模型组FN的表达　　局部丝线结扎高糖饮食使大鼠牙周组织产生炎症反应：结合上皮增生、根向迁移、钉突形成；结合上皮冠方与牙根表面分离形成牙周袋，

6、牙周袋壁上皮增生溃疡；牙龈固有层中血管增生、扩张、充血、血栓形成，炎性细胞浸润；牙龈上皮下和牙周膜冠方胶原纤维束水肿、变性、溶解、排列紊乱。　　FN的表达形式和表达强度具有明显部位特异性变化，表达强度和范围随结合上皮根向增生程度的增加而增强。在牙周袋上皮下和冠方结合上皮下结缔组织基质内，FN棕黄色颗粒表达明显减少或消失；在根方结合上皮基底面，FN棕黄色颗粒细线形表达；结合上皮浅层结缔组织内FN深棕黄色凝集团块面积实验性牙周炎8周组比实验性牙周炎4周组大；结合上皮下深层结缔组织基质内，FN棕黄色纤维

7、X状表达（图2-3）。　　　　3讨论　　3.1FN在牙龈结缔组织基质中的表达及意义　　FN是牙龈固有层结缔组织基质的主要分子成分之一，为糖蛋白。FN分子结构具有与细胞表面整合素受体和胶原纤维等物质相结合的位点，是细胞间及细胞与结缔组织间的粘附介质。I型胶原构成牙龈固有层结缔组织的大部分，使牙龈具有一定强度的张力，是重要的机体支持结构之一。　　本实验结果显示：FN在健康对照鼠牙龈固有层内均匀弥漫表达，胶原纤维染色均匀、排列规则；在实验性牙周炎鼠牙龈固有层内表达下调，胶原纤维染色不均匀、断裂、消失，血

8、管扩张充血，组织水肿。表明：牙周炎致病因素破坏牙龈胶原-FN基质X架结构，牙龈胶原-基质X架结构破坏、血管扩张充血和组织水肿是牙龈松软红肿的病理学基础。　　龈牙结合部是龈上、下菌斑积聚处，是宿主防御系统与细菌相互抗争的重要场所。某些牙周致病菌能刺激成纤维细胞、多型核中性粒细胞和巨噬细胞产生细胞外基质降解酶，同时还能产生纤维蛋白溶解酶原激活物，将纤维蛋白酶原转化为纤维蛋白酶，继而激活潜在形式的基质金属蛋白酶，降解细胞外基质。在狗实验性牙周炎组织中，可见到FN被部分降解成纤维无定形物质