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时间:2018-10-13
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1、分类号:TS205学号:201500370051硕士学位论文植物乳杆菌组胺分解酶的分离纯化及性质研究PurificationandCharacterizationofAnEnzymeCapableofHistamineDegradationFromLactobacillusplantarum研究生姓名:张沁芳指导教师:赵玉平教授孙舒扬副教授学科门类:农学专业名称:农产品加工及贮藏工程论文提交日期:2018年4月1日IIII摘要生物胺是果酒酿造过程中产生的一类不良代谢产物,以组胺为典型代表,给果酒的生产带来了隐患。植物乳杆
2、菌(Lactobacillusplantarum)能够有效降解组胺,在果酒,特别是葡萄酒中有推广应用的巨大潜力。鉴于目前有关L.plantarum产组胺分解酶的观点出现了学术分歧,获得L.plantarum表达的组胺分解酶,揭示其化学本质,是目前迫切需要解决的问题。为此,本研究自主筛选能够降解组胺的植物乳杆菌,并且以之为始发菌株,分离纯化获得组胺分解酶纯品,并研究了酶的相关性质。主要研究结果如下:1.获得兼具组胺降解和有机酸降解能力的多功能乳酸菌株。通过自主筛选,从全国多个葡萄酒产区共筛选获得了346株乳酸菌,其中具有生
3、物胺降解能力的有39株。再通过生物降酸能力和耐受能力(低pH、高酒精度、高SO2浓度)筛查,选出了一株性能卓越的多功能菌株。经生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定,确认其是一株植物乳杆菌,命名为L.plantarumSGJ-24。2.对L.plantarumSGJ-24组胺分解酶进行了分离纯化,获得了电泳纯蛋白。通过测定细胞全液、细胞外液和细胞内液的酶活力,发现该酶主要存在于细胞内部,同时也确定了最佳破碎条件—5s/5s10min。经过硫酸铵沉淀(最佳饱和度70%)、DEAE阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析,
4、得到了组胺分解酶纯酶,测得其分子量约为36kDa。3.解析L.plantarumSGJ-24组胺分解酶的生化特征和酶学性质。研究内容包括N-末端氨基酸分析、pH和温度对组胺分解酶活力性及稳定性的影响、金属离子和抑制剂对酶活力的影响。得到的实验结果为:组胺分解酶的N-端序列为丝-缬-赖-异亮-甘-异亮-天冬-甘-苯丙-甘-精-异亮-甘-精-亮;经过BLAST蛋白比对,确认该酶为3-磷酸甘油醛脱氢酶;最适反应温度为40℃,在55℃以下较为稳定,具有较宽的耐热范围;最适pH为7.5,在pH6.5~pH8.5的条件下能够稳定存在
5、;二硫苏糖醇(DTT)、2+乙二胺四乙酸(EDTA)、β-巯基乙醇和Mg抑制了酶活力,而十二烷基磺酸钠(SDS)、2+3+++2+2+Fe、Fe、K、Na、Pb和Ca能够激活该酶。关键词:生物胺;植物乳杆菌;组胺分解酶;分离;纯化IVAbstractBiogenicamines(BA)aretoxicmetabolitesthatareformedduringthewine-makingprocess.Lactobacillusplantarumhasgreatpotentialinfruitwine,especiall
6、ywinebecauseofitseffectivelydegradationofBA.However,thereareacademicdivergencesaboutthenatureoftheenzymecapableofbiogenicaminesdegradationexpressedbyLactobacillusplantarum.Therefore,itisanurgentproblemtoobtaintheenzymecapableofhistaminedegradationexpressedbyLacto
7、bacillusplantarumandrevealitschemicalnature.Therefore,thisstudyindependentlyscreenedLactobacillusplantarumwhichcandegradebiogenicamines,anduseditastheinitialstraintoisolateandpurifytheenzymecapableofBAdegradationandstudythepropertiesoftheenzyme.Themainresultsarea
8、sfollows:(1)Amultifunctionallacticacidbacteriaswithbiogenicaminedegradationandorganicaciddegradationabilitywereobtained.Finally,atotalof346LABstrainswereobtain
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