血清蛋白质的分离纯化与鉴定

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1、51041300069刘欢血清蛋白质的分离纯化与鉴定刘欢1张唯2赵澜2彭垠婷2徐波2郭小李2(1．生化专业细胞生物学51041300069导师：张红锋;2．华东师范大学生命科学学院)摘要：通过系统的生化制备与分析实验，让学生基本掌握了包括脱盐、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC和冷冻干燥在内的生化技术。从而为以后的科研工作打好基础。关键词：层析；电泳；SDS-PAGEAbstract:Bydoingbiochemichalpreparingandanalyzingexperiment,tec

2、hnologiessuchasproteinconcentrationdetecting,enzymeactivitytesting,chromatography,acetategreenelectrophoresis,HPLC,SDS-PAGEandotherbiotechnologicaltechniquesaremastered.Studentsaremadequalifiedtotheirresearchwork.Keywords:chromatography;electrophoresis;SDS-P

3、AGE一、前言生命物质的制备和分析是现代生物化学中必不可少且又非常实用的技术。本实验通过对兔血清蛋白的分离，让我们基本掌握常用的技术，初步了解了纯化技术的整体步骤和整个生化技术的整体流程，为我们以后自己分离纯化蛋白质产物建立了一个基本的概念，以及为以后的研究工作打下基础。这些技术都是常用而成熟的技术，但是一个多世纪以来，尽管生物技术有了飞速发展，它们仍一直在发挥着重要的，不可替代的作用。这些技术包括：（一）．蛋白质检测技术——电泳技术Hardy[1，2，3]发现，许多生物胶体，如蛋白质、酶等有特征的电泳迁移率（

4、electrophoreticmobilities）。此迁移率在很大程度上取决于溶液的pH。因此利用电泳特征作为对物质的鉴定引起人们广泛的兴趣。20世纪的20年代和30年代，电泳理论和实践有了很大的发展。Tiselius教授首先证明了血清是由白蛋白，α、β和γ球蛋白组成的[4]。人血清蛋白用界面移动方法分离的最佳条件是0.1mol/L（pH8.6）的巴比妥缓冲液，此时白蛋白具有最快的迁移速度，接着依次为α1、α2、β和γ球蛋白[5~8]。生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介

5、质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。迁移的方式目前可分为三类：根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特征。电泳迁移率（mobility）m规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d。聚丙烯酰胺凝胶（plyacrylamide51041300069刘欢gel,PAG）是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联试剂N,N＇-甲叉双丙烯酰胺（N,N＇-methylenebisacrylamide）在

6、有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。聚丙烯酰胺的单体形成长链，由N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。其化学结构已经清楚[9]。聚丙烯酰胺的特性，包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度以及孔径大小均取决于两个重要的参数T和C。T是两个单体的总百分浓度。C是与总浓度有关的交联百分浓度。Hjerten教授[10]在1962年引入以下两个公式来进行计算。T=(a+b)/m·100(%)C=b/(a+b)·100(%)A为丙烯酰胺的克数（g），b为N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的克数（g），

7、m为水或缓冲液的终体积（ml）。其中a和b的比例是很重要的[11]。PAGE电泳根据原理，需要在以下方面做选择：1)pH的选择考虑原则有：合适的分离胶缓冲系统、先导离子、尾随离子、浓缩胶缓冲系统、反向离子及电泳缓冲液[12,13]。2)离子强度的选择。一般来说，离子强度在0.01~0.1mol/L[14],最常用的为0.05mol/L[15]。3)凝胶浓度的选择。浓度太大则孔径较小，样品留在加样位置；太小则不能很好分离。所以必须通过实验来选择最佳的浓度。4)分子量的测定。1964年Feerguson[16]首先

8、在淀粉凝胶中证明了蛋白质分子的迁移率m的对数或相对迁移率Rf的对数对凝胶浓度T%作图，可以得到一条直线。这个现象接着在1968年由Hedrick和Smith[17]在聚丙烯酰胺凝胶中证实。SDS-PAGE技术首先在1967年由Shapiro[18]等建立，1969年由Weber和Osborn[19]进一步完善。他们发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的