分子标记及其在植物遗传育种中的应用 2

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1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用遗传标记（geneticmarker）具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁性状标记色泽，形态…细胞学标记倒位，易位，G/N/C带…生化标记同功酶…分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP……基础-基因表达结果表现型DNA碱基序列变异形态标记遗传学上稳定、可见的外部特征---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。细胞学标记染色体数目变异及结构变异，表现

2、在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。生化标记——贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白同工酶特点：经济、方便、成本较低结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基

3、因组；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。分子标记的分类（Staub等1996）分子标记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记有RAPD、AP-PCR、DAF、ISSR等双引物选择性扩增PCR主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记如SSR、STS等植物遗传研究中常用的分子标记RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD—RandomAmplifiedPolymo

4、rphicDNAs(DAF,AP-PCR)SSR—SimpleSequenceRepeatAFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphismRFLP原理：DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切5小时电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时染色：EtBr染色20分钟变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼印迹：加入0.4NNaOH，进行Southern印迹冲洗：以2×SSC冼胶，风干

5、酶切—电泳—印迹—杂交—洗脱预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5×HSB、DenhardtⅢ）中，封好后置65℃温箱中振荡5－6小时。杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱中振荡过夜。洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。—放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70℃超低温冰箱中曝光10天左右。使用磷屏仪，操作更方便。RFLP探针来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA

6、）探针cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。玉米RFLP探针：http://www.maizegdb.org/probes.Html探针标记—随机引物法25ng变性DNA5ul寡聚核苷酸2ulBSA3ul[α-32P]dCTP2ulKlenow酶加水至50ul，37℃温箱中标记2小时RFLP标记特点共显性，可以区别纯合和杂合基因型稳定、重复性强某些植物中开发探针已遍及整个基因组缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物

7、上多态性很低，使遗传图饱和度低。RAPD原理：用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。PolymeraseChainReaction-PCR3'5'5'3'TargetDNAsequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature@95˚C5'3'3'5'GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCannealprimers@60˚CTaqpolymerasebinds3’andextendsGCTCGC5'3'3'5'AGT

8、ACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNAisdoubledwitheachcycleRepeat25-40timesRAPD的操作