链球菌、肠球菌

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1、实验五链球菌及肠球菌的鉴定目的要求：1.掌握链球菌属及肠球菌属的分离培养与鉴定方法。2.掌握链球菌及链球菌的菌落特点、菌体形态及染色性。步骤与方法1、观察菌落将菌株接种于血琼脂平板上，35℃孵育18-24h后观察菌落，记录菌落大小、形态、表面、边缘、透明及颜色、有无溶血及特点。将肺炎链球菌继续孵育2-3天看菌落中心有无凹陷呈“脐状”。链球菌的溶血性β溶血性链球菌2、形态观察涂片、革兰氏染色镜检，记录镜下细菌染色性、大小、形态、排列及荚膜。肺炎链球菌S.pneumoniae形态与染色：G+球菌,矛头状,成双排

2、列，宽端相对，尖端向外,有荚膜肺炎链球菌革兰染色有荚膜肺炎链球菌荚膜染色特点肺炎链球菌S.pneumoniae培养特性：营养要求高，兼性厌氧。初次分离需提供5%-10%的CO2。18-24h后血平板上形成灰白色、圆形、针尖样的菌落。菌落周围有草绿色溶血环。肺炎链球菌S.pneumoniae培养特性：培养48h后，菌落有自溶现象，菌落的中心会出现凹陷，像“肚脐”称脐状凹陷。肺炎链球菌S.pneumoniae主要生化反应optochin试验:含5μgoptochin纸片贴于涂布有待测菌的平板上35℃孵育过夜，抑

3、菌圈大于14mm即为敏感。甲型溶血链球菌(R)肺炎链球菌(S)胆汁溶菌试验原理：胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体裂解而自溶。方法：A、平板法：在血琼脂平板上选择出待检的草绿色溶血的菌落，观察记录菌落特点，然后于菌落上加一滴去氧胆酸钠溶液，35℃孵育15-30min观察结果。B、试管法：将甲型链球菌和肺炎链球菌血清肉汤培养液1ml分别加入2支试管，再于各管中加入去氧胆酸钠溶液0.1ml，摇匀后置于37℃水浴30min后观察结果。结果判断：平板法若菌落消失为阳性，不消失为阴性，试管法

4、若液体由浑浊变透明为阳性，不透明为阴性，此试验是鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌的重要试验，后者阳性。痰标本肺炎链球菌革兰染色A群(化脓性)链球菌生物学性状球形或椭圆形，链状排列，革兰染色阳性(G＋)，无芽胞，无鞭毛，透明质酸的荚膜。1.形态与染色化脓性链球菌A群(化脓性)链球菌生物学性状营养要求高：血平板或含血清培养基；液体培养为沉淀生长；血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同菌株溶血不一，多数有透明溶血环(b溶血现象)。2.培养特性杆菌肽敏感试验原理：A群化脓性链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他链球菌对

5、杆菌肽通常耐药。方法：挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，将杆菌肽纸片（0.04U/片）贴于平板上，35℃孵育18-24h观察。结果判断：出现抑菌环为敏感，推断为A群化脓性链球菌。B化脓性链球菌杆菌肽阳性B群无乳链球菌CAMP试验原理：B群溶血性链球菌能产生CAMP因子，该物质可促进金黄色葡萄球菌β溶血素的活性，故在血琼脂平板上两菌交界处溶血能力增强，形成箭头状透明溶血区。方法：在羊血琼脂平板上，用金黄色葡萄球菌划种一条横线，在将被检菌距金葡菌接种线3mm处直角接种一短线，35℃培养18-24h观察结果。同时

6、设阳性对照和阴性对照。结果报告：在两种细菌划线的交接处出现箭头型透明溶血区为阳性，否则为阴性，此试验为B群链球菌与其他链球菌鉴别的重要试验，无乳链球菌为阳性，其他为阴性。无乳链球菌CAMP试验阳性CAMP阳性马尿酸水解试验原理：B群链球菌有马尿酸水解酶，可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可与FeCl3，结合形成苯甲酸铁沉淀。方法：取待检菌纯培养物接种于马尿酸钠培养基，35℃培养48h，3000r/min离心30min,吸取上清液0.8ml于另一试管，加入FeCl30.2ml，立即混匀，10-15min观察

7、结果。结果：出现恒定沉淀物为阳性。3、生化反应1）触酶试验：链球菌属为阴性。（6）血清学试验（链球菌快速分群乳胶凝集试验）原理：Lancefield根据链球菌细胞壁中多糖抗原的不同，将链球菌分为20多个群，对人类治病的多数为A群，偶见B、C、D、F、G群。用这6群抗原的兔免疫血清分别致敏的乳胶颗粒，与具有相应群特异性抗原的链球菌发生间接乳胶凝集反应，可在10min内对链球菌作出主要的分群鉴定。方法：挑取菌落2-3个转种于含有提取酶的试管中，使其成为乳化均匀的菌悬液，置37℃水浴15min。在卡片的相应区域滴

8、加一滴A、B、C、D、F、G致敏胶乳，再加入处理后的菌悬液一滴分别与胶乳混匀，同时在卡片相应区域加一滴控制液与任意一滴致敏乳胶混匀，作为阳性对照，轻摇卡片，观察结果。结果判断：在2-10min内发生胶乳凝集，为阳性。待检菌与哪群致敏胶乳凝集就表明该菌为相应血清群的链球菌。Lancefield血清凝集分型（7）胶乳凝集试验：原理：抗链球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被适量的溶血素“O”中和后，失去了正常水