荧光定量pcr问题疑难解答

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1、荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1.这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。     A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。       1.PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。       做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。

2、       2.PCR中混入影响反应的物质：       模板提取方法需要改进       3.样品稀释不准确：       这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。     Q：荧光定量PCR的灵敏度     A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。     Q：标准曲线要重复两三次吗?     A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于

3、4个，否则标准曲线准确性不高。     Q：关于荧光定量标准曲线的制作     A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。     Q：溶解曲线高矮     A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异

4、，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。     Q：定量PCR没有扩增     A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。        由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有

5、一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。     Q：SG的稳定性如何？      A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。       为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。SG分析的优化主要包括以下4个因素：       

6、a)SG浓度  b)引物浓度  c)MgCl2浓度  d)温度和反应次数       推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。     Q：荧光定量污染解决办法     A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。     1.配反应体系和加模

7、板要在不同的屋子进行；     2.配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；     3.分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；     4.配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；     5.PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；     6.最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。     Q：荧光定量real-timePCR重复性问题     A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这

8、样有助于改善重复性。       如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBRgreen作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。