动物肝脏dna提取和鉴定

《动物肝脏dna提取和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验五动物肝脏中DNA的制备和鉴定学时：61、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3、学习核酸染色的方法。一、实验目的：二、实验原理:要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点：如何选材，如何破碎组织细胞？如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。)设法除去RNA的污染；防止DNA酶的降解作用；（一）动物肝脏DNA制备原理选材要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺

2、、肝脏、脾脏、胰脏等。研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。细胞破碎方法—机械物理法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由

3、于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。细胞破碎方法—机械物理法有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释

4、放出细胞内含物。细胞破碎方法—化学方法(三)除去RNA的方法脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／LNaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／LNaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。(四)除去蛋白质的方法用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使

5、蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。纯的DNA样品的获得为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L-半乳

6、糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应）。DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）指示DNA样品在凝胶中的确切位置。溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基

7、对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡.溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤20kb

8、)，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA.（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度/%0.3    0.60.70.9    1.2