SNT2833-2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范.pdf

《SNT2833-2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８３３—２０１１委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犲狀犲狕狌犲犾犪狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织公布的《陆生动物手册》（２００９年版）第２．５．１４章

2、“委内瑞拉马脑脊髓炎”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：———细化了间接免疫荧光分型试验方法；———增加了血凝试验内容；———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ；———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、肖进文、李应国、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、朱来华、周启明。Ⅰ犛犖／犜２８３３—２

3、０１１版权所有·禁止翻制、电子发售委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范１范围本标准规定了委内瑞拉马脑脊髓炎的病毒分离、间接免疫荧光分型试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的委内瑞拉马脑脊髓炎检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＶＥＥ（ｖｅｎ

4、ｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎ＥＥＥ（ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东方型马脑脊髓炎ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西方型马脑脊髓炎ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系４生物安全要求本标准的病毒分离、间接免疫荧光分型试验和蚀斑减数中和试验，均需要在生物安全Ⅲ级以上

5、的实验室进行。人员需提前进行ＶＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶２０以上。５样品采集５．１试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）、柠檬酸钠抗凝剂（配制见Ａ．１．４）。５．２采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：全血、血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售５．３采集方法５．３．１血液样品无菌采集１０ｍＬ～１５ｍＬ全血，立即转至含柠檬酸钠抗凝剂（

6、终浓度为１０％）的离心管中，低温运送。５．３．２血清样品每头动物采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，低温运送到实验室。５．３．３脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．４组织样品无菌采取动物的脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６病原分离鉴定６．１病毒分离６．１．１设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、

7、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２试剂和材料６．１．２．１ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２ＭＥＭ培养基。６．１．２．３３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３操作方法６．１．３．１样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬

8、液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％体积加入样品悬液，３７℃感作１ｈ～２ｈ后加入细胞维持液，３７℃培养６ｄ～８ｄ，逐日观察２犛犖／犜２８３３—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售细胞病变。每份样品接种ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞各２瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细