SNT2863-2011 马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊（犲犪狊狋犲狉狀犪狀犱狑犲狊狋犲狉狀）２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《陆生动物手册（２００９版）第２．５．５章“马脑脊髓炎（东部型和西部型）

2、”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：———细化了免疫荧光试验方法；———细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法；———增加了血凝试验内容；———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ；———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、

3、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范１范围本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、ＲＴＰＣＲ试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３缩略语下列缩略语适用于本文件。３．１ＥＥＥ（ｅａ

4、ｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东部型马脑脊髓炎３．２ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西部型马脑脊髓炎３．３ＶＥＥ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎３．４ＷＮ（ｗｅｓｔｎｉｌｅｆｅｖｅｒ）：西尼罗河热３．５ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系３．６Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系３．７ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒ

5、ａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆转录聚合酶链式反应４生物安全要求本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。实验人员需提前进行ＥＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶４０以上。５样品采集５．１试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）。５．２采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１

6、５．３采集方法５．３．１血清样品采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．２脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．３组织样品无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６病原分离鉴定６．１病毒分离６．１．１设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２试剂和材料６．１．２．１ＲＫ

7、１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２ＭＥＭ培养基。６．１．２．３３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３操作方法６．１．３．１样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ

8、１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％