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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1181.2-2003口蹄疫病毒抗体检测方法微量血清中和试验Detectionantibodiesagainstfootandmouthdiseasevirus-Protocolofmicro-serumneutralizationtest2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总肩SN/T1181.2-2003曰出...吝~月g青本标准根据采用OIE《诊断试验与疫苗标准手册》2000年第四版2.1.1章的相关内容起草。本标准的附录A、附录B是标
2、准的资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:杨素、薛景山、吕宏、冯家望。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1181.2-2003口蹄疫病毒抗体检测方法微量血清中和试验范围本标准规定了口蹄疫病毒微量血清中和试验方法。本标准适用于口蹄疫病毒中和抗体水平的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是往日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各
3、方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992《分析实验室用水规格及试验方法》3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1CPE致细胞病变作用。3.2TCID50半数细胞感染量。3.3FMD口蹄疫。原理特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。本标准规定的中和试验是以定量病毒稀释血清为基础，当血清能阻止定量病毒50%致细胞病
4、变能力时，其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定口蹄疫血清抗体的方法。5试剂和材料5.1本标准所用水应符合GB/T6682-1992中关于三级水(三蒸水)的规格。5.2本标准所用试剂配方参见附录Ae5.3本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.4本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。5.5病毒选用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的0,A,C,SATi,SAT2,SAT。和Asia1型口蹄疫细胞毒分别作为各型血清抗体检测的标准毒。1SN/T1181.2-20035.6标准血清:标准阴性血清采用无口蹄疫病毒抗
5、体的猪血清或牛血清，标准阳性血清采用口蹄疫病毒感染发病21d的康复猪血清或牛血清。5.7细胞系:IB-Rs-2或BHK-21细胞系。5.8细胞培养基:含10%无口蹄疫病毒抗体的胎牛血清(经56'C,30min灭能)及抗生素的细胞培养液。5.9细胞维持液:含2%无口蹄疫病毒抗体的胎牛血清(经560C,30min灭能)及抗生素的细胞培养液。5.10细胞分散液。5.11固定液的配制:10%甲醛(900mL生理盐水+100mL甲醛)。5.12边仍‘液的配制.1000mL固宁液+0.5亚甲储6器械和设备6.1二氧化碳培养箱、微量振荡器、倒置显微
6、镜、冰箱(-20℃保存血清，-70℃保存种毒)。6.2100mL细胞培养瓶、96孔微量细胞培养板、吸头、多道可调移液器、单道可调移液器。预备试验7.1将口蹄疫病毒O,A,C,SAT,,SAT,,SAT,和Asia1型分别接种IB-Rs-2或BHK-21细胞单层，37℃吸附1h后加人维持液，置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，接种24h后用倒置显微镜逐日观察，待CPE达75%以上，冻融一次或置水浴中用超声波处理(40uA,1min),2000r/min离心20min，上清液分装小瓶，每瓶1mL，置一70℃保存备用。7.2病毒毒价的测定及其
7、工作浓度的配制:将病毒原液用细胞维持液做10倍系列稀释至10-m，每个稀释度作4个孔，每孔50ILL，每孔加50[AL细胞悬液(含10‘个细胞/mL)，再补充细胞维持液50pL.每块板设4孔正常细胞对照，于5%二氧化碳培养箱37℃培养，从48h开始至168h用倒置显微镜逐日观察记录CPE按Karber方法计算TCIDso。将病毒原液配制成100TCIDso/50pI，待用.7.3将标准阳性血清、阴性血清、被检血清经560C30min灭能，待用.7.4将细晌用细响培养液稀释成10“个细胞/mL,待用中和试验81对照设立8.1.1细胞对照
8、:设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液50pL(含10‘个细胞/mL)、细胞维持液100pLo8.1.2阳性对照:将已知滴度的标准阳性血清用细胞维持液在96孔微量培养板上从1:4开始做对倍系列稀释，每个稀释度作4个孔，每孔
