SNT1181.1-2003-口蹄疫病毒感染抗体检测方法琼脂免疫扩散试验.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1181.1-2003口蹄疫病毒感染抗体检测方法琼脂免疫扩散试验Detectionantibodiesagainstfootandmouthdiseasevirusinfection-associatedantigen-Protocolagargelimmuno-diffusiontest2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局sx/T1181.1-2003前言本标准根据OIE/Chapter2.1.

2、1,4thedition,2000,《诊断试验和疫苗标准手册》(Manualofstand-ardsfordiagnosticTestsandVaccines)起草。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:徐海聂、薛景山、潘文波、廖秀云。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1181.1-2003口蹄疫病毒感染抗体检测方法琼脂免疫扩散试验范围本标准规定了口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试

3、验操作规程.本标准适用于易感动物血清中口蹄疫病毒感染相关抗原(VIA)之抗体检测，适用于各型口蹄疫的检疫(无型别特异性)、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格及试验方法缩略语下列缩略语适用于本标准。3

4、.1AGIDagarimmuno-diffusiontest琼脂免疫扩散试验。3.2FMDfootandmouthdisease口蹄疫。3.3VIAvirusinfection-assoxiatedagainst病毒感染相关抗原。3.4Tris-HCl三经甲基氨基甲烷一盐酸溶液。原理抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同。当抗原和相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物

5、，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状或带状，其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。琼脂免疫扩散试验即根据标准抗原与被检血清之间是否出现沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。SN/T1181.1-20035试剂和材料5.1本标准所用水应符合GB6682-1992中关于三级水(三蒸水)的规格。5.2VIA抗原:为A型或O型口蹄疫病毒感染细胞的提取物，由指定单位提供.5.3标准阳性血清:为A型或

6、O型口蹄疫病毒免疫牛或猪制备的抗血清，由指定单位提供。5.4被检血清:按常规方法采血并分离血清,56℃水浴灭能30min后使用，也可置4℃冰箱中备用或置一20℃中冻结长期保存.避免反复冻融.5.5试剂:三径甲基氨基甲烷(Tris),抓化钠(NaCD,叠氮钠(NaN,),盐酸(HC!),琼脂糖，均为分析纯。5.6器材:吸管、量简、平皿、三角瓶、外径4mm的金属管专用打孔器,20leL-I00kL微量取液器及吸头、观察灯等。5.7琼脂糖凝胶板的制备:称取1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加人100mLTri

7、s-HCl(配置见附录A),于1210C高压15min或100℃水浴煮沸，使琼脂糖充分融化当冷却至约60℃时将琼脂糖溶液注人平皿中，使凝胶厚度为2mm-3mm。待自然冷却凝固后，将平皿倒置于湿盒中，4℃冰箱密封备用。5.8模板:由1个中央孔和6个均匀分布的周边孔组成，各孔孔径和孔间距均为4mm，见图1。样品量大时按图2制作模板。户O图1图26试验操作步骤6.1打孔:将模板放在凝胶板上方，打孔器垂直插人模板孔中并穿透凝胶直至底部。打完孔后，轻轻挑出或吸出孔中的凝胶块，用烫烙法或底部加热法封住孔底(使

8、用一次性树脂平皿除外).6.2加样:用微量移液器吸取抗原悬液加人@孔，阳性对照分别加人外围的。孔中，被检血清按顺序分别加人其余各孔中，每孔均以加满不溢出为度。每加一个样品应换一个吸头。6.3扩散:加完样后盖上平皿盖，静止10min后倒置于湿盒中，于室温(220C^-250C)下任其自由扩散24h-72hSN/T1181.1-20037结果判定7.1加样后24h开始观察，每天观察并记录，至72h做最终判定.7.2当标准阳性血清与中心抗原孔之间出现一条清晰致密沉淀线时，本试验成立，否则