TNFα通过抑制cyclin D1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱导大鼠BTB成熟延迟

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1、分类号：Q5单位代码：10159密级：公开学号：201520038硕士学位论文中文题目：TNFα通过抑制cyclinD1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱导大鼠BTB成熟延迟英文题目：TNFαstimulatestheproliferationofimmatureSertolicellsbyattenuatingUPS-degrationofcyclinD1andleadstothedelayofBTBmaturation论文作者：吴卫星指导教师：宿文辉副教授学科专业：生物化学与分子生物学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文TNFα通过抑制cycli

2、nD1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱导大鼠BTB成熟延迟TNFαstimulatestheproliferationofimmaturesertolicellsbyattenuatingUPS-degrationofcyclinD1andleadstothedelayofBTBmaturation论文作者吴卫星指导教师宿文辉副教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科生物化学与分子生物学研究方向TNFα对支持细胞增殖的影响论文起止时间2017年3月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学

3、位论文中国医科大学硕士学位论文摘要目的：在哺乳动物睾丸中，支持细胞（Sertolicell，SC）对生殖细胞的发育至关重要，SC的最终数目决定精子的产生能力。SC增殖仅发生在胎儿和青春期前期，主要由卵泡刺激素和旁分泌因子调节，在此期间的未成熟SC可能成为影响睾丸发育的致病性因素的重要靶点。TNFα（tumornecrosisfactorα）在睾丸中具有多种生物学活性，参与生精细胞发育的多个过程。SC是TNFα发挥病理或生理性作用的主要靶点。TNFα通过识别SC上的受体参与成熟BTB（blood-testisbarrier）周期性重建、细胞凋亡和炎症反应。研究发现，T

4、NFα可诱导体外培养的未成熟SC增殖，但缺乏其调节途径和作用机制研究及体内实验验证。本研究试图揭示TNFα影响未成熟SC增殖的作用机制及其对BTB成熟过程的影响。方法：1.TNFα对未成熟SC增殖的影响及泛素化PCRArray筛选差异基因。体外分离培养10d龄SD鼠原代SC培养1-7d，于第2d给予不同浓度TNFα处理，于不同时间点分别采用①CCK-8、EdU检测细胞增殖率；②泛素化PCRArray筛选差异基因，qPCR验证TNFα（10ng/ml）对Fbxo4表达影响；③免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclinD1表达水平；④免疫共沉淀检测Fbxo4与cyc

5、linD1的相互作用及cyclinD1泛素化水平。2.Fbxo4过表达对TNFα促SC增殖效应的影响。构建含大鼠Fbxo4基因全长的腺病毒重组质粒，包装病毒颗粒后选取适宜MOI值于培养第2d感染原代未成熟SC24h，于第4d进行TNFα处理，检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。3.抑制NFκB活性对TNFα促SC增殖效应的影响。免疫印迹检测相关信号通路蛋白活性。体外培养10dSD大鼠SC，筛选抑制NFκB通路的最佳PDTC浓度，于第2d采用PDTC（10μM）预处理SC2h后加入TNFα联合处理48h，检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。4.体内研究检测TNFα

6、对未成熟大鼠BTB功能建立的影响。体内实验选取12d未成熟的雄性SD大鼠作为研究对象。连续3d每天腹腔注射TNFα（10μg/kgbw），对照组注射等体积的ddH2O，于不同时间点（16d、20d、24d、26d、30d、32d、35d）进行如下实验：①生物素标记法检测大鼠体内BTB通透性，比较各组BTB功能成熟的时间点；②免疫荧光检测BTB连接蛋白分布；③免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclinD1和连接蛋白水平。结果：1.TNFα抑制cyclinD1泛素化并促进未成熟SC的增殖：CCK-8、EdU实验和PCNA表达水平变化显示TNFα处理明显促进未成熟SC

7、增殖；泛素化PCRI中国医科大学硕士学位论文Array筛选出5个相关差异基因（>3倍）；免疫印迹显示TNFα显著下调E3泛素连接酶Fbxo4，而其底物cyclinD1水平升高；免疫共沉淀显示TNFα抑制了cyclinD1与Fbxo4的相互作用及其泛素化。2.Fbxo4过表达抑制TNFα对未成熟SC的促增殖作用：腺病毒Ade-Fbxo4体外感染原代未成熟SC，免疫印迹检测Fbxo4成功过表达；CCK-8和EdU试验表明，与Adv-Fbxo4组相比，Adv-Fbxo4+TNFα组细胞增殖无显著变化；免疫印迹及免疫沉淀结果显示，与Adv-Fbxo4组相比，Adv-Fb