谈川芎素对结直肠癌lovo 细胞生长的体内外抑制作用及机制

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1、谈川芎素对结直肠癌Lovo细胞生长的体内外抑制作用及机制　　中药是我国的特色治疗方式之一，目前已有多种中药制剂获批用于常规手段无效时的肿瘤治疗。川芎素广泛用于心脑血管疾病的治疗，近年来其抗肿瘤活性成为研究的热点。川芎素对人结直肠癌是否具有抑制作用，目前尚不明确。2015年5月～2016年5月，我们在体内外观察了川芎素对结直肠癌Lovo细胞的抑制作用，并探讨其可能的机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　川芎素(阿魏酸钠)成都制药一厂生产，100mg/支，工作浓度100mg/mL，人结直肠癌Lovo细胞购自中科院细胞库，

2、RPMI1640培养基购自GIBCO公司;AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒购自南京凯基公司，鼠抗人pro-Caspase3单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自Santa公司;SPF级裸鼠购自上海实验动物中心。　　1.2实验方法　　1.2.1细胞培养与分组处理37℃、5%CO2下将Lovo细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养，将对数生长期的细胞分为两组。观察组分别与终浓度为0.125、0.25、0.5、1.0mg/mL川芎素共培养，对照组不加川芎素。　　1.2.2Lovo细胞活力观察采用MTT法

3、。将对数生长期的细胞制成1105/mL的细胞悬液，以100L/孔接种96孔板，分组处理同1.2.1。培养24h每孔加入5mg/mL的MTT20L，孵育6h每孔加入20%的SDS50L/孔，过夜，测定570nm吸光度(A)值。细胞活力指数=(观察组A570/对照组A570)100。　　1.2.3Lovo细胞周期检测取对数生长期Lovo细胞，分组处理同1.2.1。培养24h后以70%冰乙醇固定细胞，4℃碘化丙啶避光染色30min，用FACSCalibur检测细胞周期。　　1.2.4Lovo细胞凋亡检测取对数生长期的Lovo

4、细胞，分组处理同1.2.1。分别于培养6、12、24h，以3000L1缓冲液[100mmol/LHEPES(pH7.4)，1.4mmol/LNaCl，25mmol/LCaCl2]悬浮细胞，调整细胞密度为1106/mL。取100L细胞悬液到流式管，加入5LAnnexinV-FITC和10LPI(20g/mL)，避光孵育20min，加入400LPBS后用FACSCalibur检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。　　1.2.5川芎素体内抑瘤作用观察取裸鼠14只，于其左腋下靠背部皮下注射Lovo细胞悬液100L。10d后待肿瘤体积至

5、约100mm3，随机将裸鼠分2组各7只。观察组静脉注射0.5mg/mL的川芎素50L，对照组静脉注射等量生理盐水，隔日给药7次。给药前及给药后每隔2d测量裸鼠瘤体长径(L)和短径(W)。肿瘤体积(mm3)=1/2W2L。　　1.2.6Lovo细胞及肿瘤组织Bcl-2、pro-Caspase3检测采用Westernblot法。取对数生长期Lovo细胞随机分为两组，观察组与终浓度1mg/mL的川芎素共培养，对照组不处理。收集培养24h后的细胞，并分离两组裸鼠肿瘤组织;抽提蛋白，SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，5%BSA

6、封闭;加入1∶4000稀释的鼠抗人Bcl-2单抗或1∶5000稀释鼠抗人pro-Caspase3单抗，以1∶2000稀释的鼠抗人-actin作内参，4℃孵育过夜;加1∶2000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1h;洗膜，检测并扫描，以目的条带与内参条带的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。　　1.3统计学方法采用SPSS15.0统计软件。结果以珋xs表示，数据比较采用单因素方差分析及LSDt检验。P0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1川芎素对Lovo细胞活力的影响观察组分别与终浓度为0.125、0.25、0

7、.5、1.0mg/mL川芎素共培养24h后，其细胞活力指数分别为81.236.58、75.696.34、62.183.29、58.392.69。终浓度0.125mg/mL与终浓度0.5、1.0mg/mL的细胞活力指数比较，P均0.05。其他浓度间比较，无统计学意义。　　3讨论　　目前，川芎素已广泛用于治疗脑血管病、冠心病、白细胞和血小板减少症等疾病。川芎素药理作用复杂，研究表明其具有抗氧化及抑制血栓形成等效果，还有报道川芎素能够抑制氧化导致的平滑肌细胞增殖，但是川芎素和肿瘤细胞生长的关系研究较少。本研究结果发现，隔日瘤

8、内注射0.5mg/mL川芎素治疗荷Lovo细胞豚鼠，7次用药后，与对照组比较，其肿瘤体积明显缩小。这表明Lovo细胞的生长能被川芎素抑制，与本研究MTT实验结果相互印证。G1/S期和G2/M期是细胞周期两个重要检测点，在此期能够发现DNA的损伤甚至突变，阻滞受损的细胞于相应位点上并进行修复DNA，只有DNA修复完好后，接下来的细胞