胰蛋白酶活性测定

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1、实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argineethylester,BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253nm的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253nm的消光值调为零，然后记录反应体系对253nm的消光值的增量，并把这个

2、增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程1cm，波长253nm，温度250C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（DA/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1%酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1%值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品

3、的E1%的测定值配制溶液。在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI,Tris。1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。62)按照表1的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标

4、准胰蛋白酶的活性。表1胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步骤1：空白调零步骤2：样品测定0.1mol/LTris-HCl缓冲液,pH8.0,1.5mL1.5mL2.0mmol/LBAEE1.5mL1.5mL250C预热5min250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL0mL10mL蒸馏水10mL0mL充分摇匀充分摇匀步骤1：DA253nm/min调0-----------步骤2：DA253-nm/min--------------记录在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。

5、测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5mL-20mL之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。3分别求算：1)标准胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii)胰蛋白酶比活计算:(用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活)6实验二胰蛋白酶动力学测定实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数kc

6、at,特异性常数kcat,/Km。实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度250C。反应产物之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA和另一个产物BA对40

7、5nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变化。L-BAPA最大浓度低于5´104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数。Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[Si]，测定每一个底物浓度条件下的反应速度ni,然后用[Si]/ni对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是Km/Vmax,线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到Km和Vmax值；kcat=Vmax/[Et]

8、。[Et]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此kcat可以得出；特异性常数Km/kcat可根据上述已知数计算出来。器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。试剂：61．0.1mol/LpH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）：取0.2mol/LTris（Mr=1