碱性纤维素酶产生菌的分离和筛选1

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1、碱性纤维素酶产生菌的分离和筛选摘要：纤维素物质是自然界中最丰富的一种可再生资源，而有些菌类能产出纤维素酶，在纤维素降解为可利用能源上具有重要意义。纤维素酶主要来自于真菌和细菌。利用CMC透明圈分离法初步筛选出具有碱性纤维素酶活性的菌株；在此基础上进行液体培养，通过测定该菌不同时期的OD值,，绘制生长曲线。并用革兰氏染色法进行形态观察，最后保藏优良菌种。关键字：碱性纤维素酶透明圈革兰氏染色一.实验器材：1.样品从深圳红树林自然保护区湿地取样，分装到3个250ml锥形瓶，置于冰箱中。2.培养基固体鉴别培养基：营养肉汤1.8g，CNC-Na2g，琼脂2g，蒸馏水100ml，用NaOH调pH至

2、9.0，灭菌。分别到平板到6个平板中，每2个一组，分为3组，分别为10-410-510-6。液体发酵培养基：养肉汤1.8g，蒸馏水100ml，用NaOH调pH至9.0，灭菌。分个装到2个100ml的锥型瓶中。3.其它器材与试剂大量无菌水涂布器移液管移液枪枪头分光光度计二.实验步骤：1.从样品土壤中去适量土样，用无菌水洗涤振荡均匀，吸取上清液稀释至10-4，10-5，10-6，分别涂布于对应的平板上,放于37℃恒温培养箱中培养48h后，取出观察。2.如果出现的透明圈不明显，往培养皿中加入适量1mg/mL的刚果红溶液,染色1h，弃去染液,加入适量1mol/L的NaCl溶液,洗涤1h。中间出

3、现未被染红的白圈就是碱性纤维素产酶菌。3.将能产生碱性纤维素酶的菌种进一步分离筛选。先从涂布的培养基上挑取单一的菌落，将其溶于少量无菌水中，再采用划线的方法挑取一环溶解的菌液在平板上分离纯化。37℃培养48h，如果48h后不能观察到明显的单个菌落，重复一遍。4.在载玻片上滴一滴水，用接种环从平板中的单个菌落上挑取一些侵入水中，加入结晶紫溶液染色2min。用清水冲洗后滴加碘液，染色2min。用清水冲洗后再用乙醇冲洗，直到玻片上不再留有残余的染液，流下的水无色为止。最后用番红染色2min，用清水冲洗。涂面朝上，通过火焰2 ~ 3 次，烘干玻片在显微镜下进行观察。若为红色，为革兰氏阴性菌，若

4、为紫色，为革兰氏阳性菌。5.用接种环从平板中挑取单菌落后，在无菌水中涮洗下接种到100ml的液体发酵培养基中，另一瓶接入等量的无菌水作为对照。放入37°恒温震荡培养箱中进行培养，每隔一段时间取出进行OD值检测，以未接种的培养基液为对照。根据时间和吸光值的关系画出生长曲线。三.实验结果1.涂布平板的生长状况由于发现10-410-6组中，菌不是太多，就是太少，透明圈不明显，所以实验结果均采用了10-5组的。未加刚果红的平板，在黑框出，可以发现明显的透明圈。加了刚果红染色后的平板，可以发现，这样可以更加明显的找到目的菌，其中的白圈很明显划线分离纯化的最终结果，已经基本形成单菌落。革兰氏染色后

5、的结果，发现目的菌明显被染成了紫色，说明其为革兰氏阳性菌。碱性纤维素酶产生菌在600nm下的吸光度时间0h2h4h6h17h22h47h78h93h96h121h145hOD值000.0010.0030.160.1750.2290.2470.3970.3990.3860.342碱性纤维素产生菌的生长曲线碱性纤维素酶产生菌不同时期的时间段生长时期迟缓期对数期稳定期衰亡期时间段/h0-66-9393-121>121四.分析与讨论：1.碱性纤维素酶的水解作用机制在目的菌附近产生的抑菌圈是由于菌产生的碱性纤维素酶在碱性的环境下被激活，分解CMC-Na，由于CMC-Na被分解，于是培养基变得透明

6、，，因为原来的浑浊状态是由于加了CMC-Na才导致的。根据透明圈的大小，可以判断出菌落产酶能力的高低。下面简单介绍下碱性纤维素酶的水解作用机制。纤维素酶是具有不同底物特异性的多酶复合物，普遍认为是纤维素酶各组分协同作用的结果，其特异性水解纤维素b-1,4糖苷键的机制可以从下面图说明：纤维素酶对糖苷键的水解主要通过酶活性中心的Asp或Glu上的羧基完成一个为解离的带负电荷的羧基，另一个为非解离的不带电荷的羧基：首先，带负电荷的羧基对b-1,4糖苷键上的1号C进行亲核攻击，形成碳氧离子的过渡态；其次，另一个非解离的羧基同时对b-1,4糖苷键上的O原子进行亲电攻击，形成氢键，使得b-1,4糖

7、苷键上的C-O单键不稳定而断裂。糖苷键的断裂而得到的其中一个葡萄糖残基和酶活中心的非解离羧基以氢键相连，很容易从酶分子上脱离，得到自由的葡萄糖残基和酶活中心的羧基。最后，另一个葡萄糖残基的羟基以共价键和酶活中心的羧基相连，这种连接在另一个自由羧基的亲核攻击下断裂，酶分子被还原，并产生两个短的纤维素分子，酶水解完成。2.目的菌的革兰氏染色与形态观察通过2次的革兰氏染色，都发现其菌体被染成了蓝紫色，说明我们筛选出来的菌为革兰氏阳性菌。在通过高倍显微