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1、大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵作者：丁少云指导老师：江诚(安徽医学高等专科学校，安徽合肥，231000)摘要：目的:探索获得大肠杆菌的高密度发酵和高效表达分泌型重组人干扰素α-2b的方法。方法:通过小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2b发酵的基本条件;通过中试研究碳源、氮源等营养物质补加的方式;同时就单独补充碳源、分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行对比分析。结果:经优化后的发酵条件,最终菌体的光密度可达A600=70,分泌型重组人干扰素α-2b终产品为120g·L-1菌体,平均比活性为2.2×108IU·mg-1蛋白。结论:获得了较满意的高密度发酵
2、条件和重组人IFNα-2b的高表达条件。关键词：重组人干扰素α-2b;大肠杆菌;发酵1.引言干扰素α-2b(interferonα-2b,IFNα-2b)是由165个氨基酸组成的单链多肽,理论分子量为19219,由两对二硫键构成,有一定空间结构,其中29-138位的二硫键对于维持活性尤其重要[1]。干扰素是最早通过基因工程技术表达的蛋白质之一。利用传统的胞内表达方法有一定的缺陷,如蛋白始终以还原状态存在,无法形成正确的三级结构。本课题组利用分泌型表达技术构建的IFNα-2b工程菌,使所表达的外源蛋白直接分泌于细菌的细胞间质中,有利于蛋白质纯化;同时,所表达的蛋白同天然
3、IFNα-2b有相同的一、二、三级结构,因此有100%的生物学活性。本实验研究了大肠杆菌重组人IFNα-2b的发酵工艺,对比单独补充碳源、同时补充碳源和氮源的两种不同方式的发酵方法,获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFNα-2b的高表达条件。2.材料与方法2.1菌种工程菌为E.coliJM101,基因型F-mcrAmcrBIN(rrnD-rrnE)lamda,来自ATCC;IFNα-2bcDNA来自安徽农业大学免疫学教研室;用于构建表达质粒的起始质粒PSTⅡ其结构包括碱性磷酸酶启动子(phoApromoter)、翻译增强子序列、SD序列、STⅡ信号肽序列、Amp及
4、Tet抗性基因、复制起点。2.2发酵罐B.Braun5L发酵罐、Applican40L发酵罐。2.3培养基①种子培养基:LB培养基;②筛选培养基(g·L-1):葡萄糖2g、酵母粉1.2g、蛋白胨15g、NaCl1.2g、NH4Cl0.96g、MgSO4·7H2O0.494g、调pH至7.5;③发酵基本培养基(g·10L-1)NaH2PO4·2H2O8.5g、K2HPO4·3H2O22.3g、(NH4)2SO442g、MgSO4·7H2O12g、葡萄糖10g、酵母粉50g、蛋白胨36g、柠檬酸三钠9.65g,微量元素5mL。其中微量元素混合物成分:Fe、Co、Mo、Zn
5、、Cu、Mn、B等;④补料:a.50%葡萄糖(105℃灭菌20min);b.蛋白胨45g,酵母粉14g,溶解于1L水中;c.采用单独流加葡萄糖方法,需在每升发酵基本培养基中另加入蛋白胨4.5g,酵母粉1.4g。使用发酵罐培养时,不应加入任何抗生素。2.4检测方法通过SDS-PAGE电泳,并经VDS扫描仪分析IFNα-2b的表达量;通过尿糖检测试剂盒检测发酵培养过程中糖的变化;中试发酵结果的研究采用低渗裂解方法,并通过SDS-PAGE电泳法检测蛋白量;对40L发酵罐中试结果的分析,均采用统一的纯化工艺路线;终产品检测方法及质量标准符合《中国药品生物制品检定规程》(200
6、0版)有关规定。2.5大肠杆菌重组人IFNα-2b发酵基本条件发酵基本条件的摸索采用摇瓶完成,通过SDS-PAGE检测IFNα-2b表达量来决定发酵基本条件的优劣。小试实验条件相同:划LB平板(含Tet,37℃培养过夜),挑取单克隆,接种于10ml液体培养基中(含Tet)。37℃培养至A600在1.5左右,分别进行下面的不同实验,每组实验均采用筛选培养基,接种量均为5%,摇床转速220r·min-1。2.6发酵培养周期通过分泌型表达技术构建的工程菌,结构中包括碱性磷酸酶启动子(phoApromoter),其特点是随着培养基中磷酸盐的逐渐消耗,出现低磷酸盐条件时,开始诱
7、导表达分泌IFNα-2b。采用5L发酵罐和发酵培养基,采用单流加葡萄糖补料,并控制比生长速率。在37℃、pH7.0、保持溶解氧不低于30%的发酵培养条件下,确定IFNα-2b工程菌的发酵周期。2.7中试发酵工艺研究中试发酵工艺是在5L发酵罐结果基础上进行线性放大,采用40L发酵罐进行研究。既往关于采用流加补料的形式获得相对高密度的发酵结果的研究已经很多,故未将其列入,而重点研究单补糖及补糖、补氮结合的流加方式的比较。将发酵工程菌划种LB平板,37℃培养过夜,挑单菌落,接种于10mlLB(含Tet)的三角瓶中,37℃培养至A600=1.0,再在摇瓶中(
