离子交换柱层析分离与纯化凝集素

《离子交换柱层析分离与纯化凝集素》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、离子交换柱层析分离与纯化凝集素一、实验目的本实验以红花石蒜为材料，将其粗提液进行硫酸铵沉淀后，再用离子交换柱层析进行分离。本实验的目的是：了解离子交换层析技术的原理，掌握用离子交换层析技术分离蛋白质的基本技术。二、实验原理离子交换层析分离蛋白质的过程,主要是利用蛋白质具有不同的电荷而进行分离。依靠增加缓冲液中的离子强度或改变pH值使蛋白质带不同种类和数目的电荷，改变蛋白质与离子交换剂的结合状况,从而使不同的蛋白质得以分离。要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度

2、和pH值），使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。离子交换剂是连接有离子基团的不溶性惰性颗粒，可由多种材料制成,如纤维素,葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶和合成树脂。常用于蛋白质分离纯化的离子交换剂为离子交换纤维素,离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。带正电荷的离子交换剂可以靠静电结合阴离子，称为阴离子交换剂。带负电荷的离子交换剂称为阳离子交换剂。离子交换剂根据带电基团解离程度的不同,又有强弱之分。强离子交换剂的带电基团在所有pH范围内解离；弱离子交换剂的带电基团的解离状态则取决于pH，只在一定pH范围内解离。本实验采用的凝胶柱为DEAE-

3、Sephrose阴离子交换琼脂糖凝胶柱。三、试剂与器材主要试剂：弱碱型阴离子交换琼脂糖凝胶：DEAE-Sephrose，NaOH，NaCl，Tris，盐酸，乙醇。主要溶液：生理盐水、0.5MNaOH溶液、0.05M,pH7.6Tris-HCl缓冲液、0.05M,pH7.6含1MNaCl的Tris-HCl缓冲液主要器材：离子交换层析柱、储液瓶、梯度洗脱仪、紫外检测仪和记录仪、部分收集器、pH计、恒流泵、透析袋四、试剂配制1．配制1L，0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液（Mr=121.14）称量60.57gTris，加入400ml蒸馏水将粉末溶解后

4、，加入适量盐酸调pH值至7.6，最后定容至1L2．配制2L,0.05M,pH7.6的Tris-HCl缓冲液取200ml0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液定容至2L，分4瓶存放（500ml/组）3．配制2L,含1MNaCl的0.05M,pH7.6的Tris-HCl缓冲液取200ml0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液，称量117gNaCl，定容至2L，分4瓶存放（500ml/组）4．配制1L0.5M的NaOH溶液称量20gNaOH，定容至1L，分4瓶存放。五、材料石蒜鳞茎采自四川西部山区，12月-1月成熟的鳞茎新鲜兔血采自菜市场，以生理盐水

5、洗涤三次，至离心上清无色，备用六、操作步骤1．凝胶柱的准备(1)离子交换剂的制备:DEAE-Sepharose阴离子交换剂的制备：按试剂说明将凝胶用低水水洗，洗去残留的乙醇，抽干，用0.5MNaOH（含1MNaCl）浸泡2小时，抽干，水洗至中性。用带有所要离子的溶液浸泡离子交换剂,而后再用蒸馏水冲洗至中性。⑵装柱:①将柱子固定于铁架上,用铅垂校正垂直。②加入洗脱液，打开柱出口排除气泡.待柱内剩余约2cm柱高的液柱时，关闭柱出口。③调节凝胶悬液,使凝胶与溶液之比约为3比1。④将凝胶悬液充分混合，然后一次性倾入柱内，注意此时凝胶的温度与层析时的温度一致。⑤

6、待凝胶自然沉降形成1-2cm高的凝胶柱后，打开出液口，直到凝胶沉降到所需要的高度为止。⑥柱沉降形成以后，用洗脱液滴注平衡2-3个柱床体积，使凝胶柱床稳定，平衡时流速可稍大于层析时的流速。还应注意胶面上保持2-3cm液柱，以防柱床干掉对于装好的柱，以10倍柱体积的起始缓冲液平衡柱体。2．石蒜凝集素粗提液的制备⑴将石蒜球茎上的泥土洗净，加入3倍生理盐水，用搅拌器匀浆，在4℃下放置过夜，过滤得到上清液。⑵将上清液进行硫酸铵分级沉淀（30～60％），3500rps离心20min，得到凝集素粗品。3．紫外吸收法对蛋白质浓度的测定取石蒜凝集素粗品溶液，过滤。取1m

7、l滤液，稀释10倍，用紫外分光光度仪测定溶液在260nm和280nm的吸收值，根据公式：1.45*OD280－0.74*OD260计算蛋白质浓度。4．石蒜凝集素的分离和纯化⑴将粗品以0.05MpH7.6的Tris-HCl缓冲液透析除去硫酸铵⑵用相同的缓冲液平衡的DEAE-SephroseFF离子交换柱⑶上样：取滤液200ml，以2ml/min（大约2-3秒/滴）的流速上柱。⑷洗脱：上样结束后，用缓冲液以5ml/min流速洗脱至OD280<0.02，改用0～1mol/LNaCl溶液进行连续梯度洗脱至OD280<0.02,以处理好的新鲜兔红细胞检测活性,收

8、集活性部分透析除盐,浓缩保存。5．柱子的清洗：0.5MNaOH溶液（含1MNaCl）七、实验结