截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文.doc

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1、硕士学位论文截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文目录摘要IAbstractIII第1章绪论11.1工业微生物制药技术概述11.1.1菌种的获得11.1.2高产菌株的选育21.1.3菌种保藏技术21.1.4发酵工艺条件的确定31.1.5发酵产物的分离提取31.2截短侧耳素国内外研究现状41.2.1截短侧耳素简介41.2.2截短侧耳素的结构与活性41.2.3截短侧耳素产生菌及其选育61.2.4截短侧耳素的发酵71.2.5截短侧耳素的提取81.3重离子辐照微生物育种91.3.1重离子加速器与重离子束概述91.3.2

2、重离子辐照在微生物育种中的应用111.4微生物发酵过程优化与响应面法实验设计121.5高通量技术与微生物筛选141.5.1高通量技术概述141.5.2高通量技术在微生物育种中的应用151.6本研究的主要内容与意义17第2章重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌182.1材料与方法182.1.1菌种182.1.2仪器182.1.3培养基与培养方法182.1.3辐照样品的处理192.1.4辐照方法及剂量的选择192.1.5菌种的保藏192.1.6辐照诱变后致死率和致死剂量的确定192.1.7截短侧耳素含量测定方法192.2结果与分析

3、202.2.1贯穿辐照截短侧耳素产生菌的致死率202.2.2注入辐照截短侧耳素产生菌的致死率与致死剂量212.2.3注入辐照后存活菌株的正突变率212.2.4注入辐照诱变高产菌株的筛选222.3讨论23硕士学位论文第3章截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化243.1材料与方法243.1.1菌种243.1.2培养基配方243.1.3仪器243.1.4产量分析方法243.2结果与分析253.2.1主要影响因素的确定253.2.2最佳发酵培养基的确定273.2.3优化培养基的验证293.3讨论29第4章截短侧耳素高产菌高通量

4、筛选方法的建立304.1材料与方法304.1.1菌种与培养304.1.2试剂与仪器304.1.3高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量314.1.4特征波长的确定314.1.5高通量测定方法标准曲线的绘制324.1.6常规发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定324.1.7高通量固体发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定324.1.8统计分析方法324.2结果与分析324.2.1高效液相色谱法中截短侧耳素标准曲线的绘制结果324.2.2Clitopiluspasseckerianus高通量固体发酵与常

5、规发酵的比较334.2.3紫外检测方法特征波长344.2.4高通量检测方法的标准曲线354.2.5高通量检测方法的精密度354.2.6高通量检测与常规检测的比较364.2.7高通量筛选与常规筛选的比较374.2.8高产菌株产量的稳定性394.3讨论39结论与展望41参考文献43致谢46附录（硕士期间发表论文）47硕士学位论文摘要截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等真菌担子菌Clitopiluspasseckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。以截短侧耳素为起点人工

6、合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopiluspasseckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用

7、。优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下：1.重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。得到了碳离子诱变Clitopiluspasseckeri

8、anus的最适诱变方式和最适剂量为离子注入辐照40Gy，为进一步利用碳离子辐照诱变Clitopiluspasseckerianus提供了一定的理论依据，并筛选出一株截短侧耳素高产菌株K40-3，摇瓶效价达到16120μg/mL，较出发菌株提高25.3%。2.截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化本研究利用响应面法对碳