小鼠ipr1基因与egfp基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

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1、小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达作者：李娜,朱道银,帖儒修,王瑜伟【摘要】　　目的:构建小鼠胞内病原体抗性基因1（Ipr1）基因与EGFP基因融合表达载体,观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达。方法:从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RTPCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pEGFPC1载体中,筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFPIpr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,以空质粒pEGFPC1转染组作为对照。采用RTPCR法检测Ipr

2、1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。结果:扩增出小鼠Ipr1基因编码序列,经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFPIpr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达,Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。结论:成功地调取小鼠Ipr1基因,构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达。Ipr1编码蛋白定位于细胞核内,提示其是一种调节蛋白。【关键词】Ipr1基因结核病绿色荧光蛋白定位　　[Abstract]AIM:Toconstructa

3、neukaryoticexpression12vectorcontainingthefusiongeneofmouseIpr1andEGFPandtostudyitsexpressioninmurinemacrophageRAW264.7.METHODS:ThecodingsequenceofIpr1genewasamplifiedfromthetotalRNAofC57BL/6JmousethymusbyRTPCR.ThegenewasclonedintopEGFPC1andtherecombinantplasmidwasidentifiedby

4、PCR,restrictendonucleasedigestionandsequencing.ThenthepEGFPIpr1wastransientlytransfectedintoRAW264.7.TheexpressionofIpr1geneandfusionproteinwasdetectedbyRTPCRandlaserscanningconfocalmicroscopy.RESULTS:ThewholecodingsequenceofIpr1wassuccessfullyamplified.Therecombinantplasmidwa

5、sidentifiedbyPCR,restrictendonucleasedigestionandsequencing.Thefusionproteinwassuccessfullyexpressedinthetargetedcellsanditslocalizationwasinnucleus.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressionvectorpEGFPIpr1hasbeensuccessfullyconstructed.ThefusionproteincanbeexpressedinmurinemacrophageR

6、AW264.7andlocatedinnucleus.　　[Keywords]Ipr1gene;tuberculosis;pEGFPC1;location　　结核病位居单一病原体引起患者死亡的传染病之首,全球每年死亡200余万人。我国属结核病高负担国家,结核病感染人数居全球第二。感染结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,12Mtb）的人中仅10%的人发展为结核病,除环境等因素外,遗传可能决定了机体的易感性[1]。2005年Pan等[2]在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因,称为胞内病原体抗性基因1（in

7、tracellularpathogenresistance1,Ipr1）,该基因与结核病的易感性有着密切的关系。Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死,从而有利于细菌在宿主体内的繁殖与扩散;而表达Ipr1基因的小鼠,巨噬细胞则发生凋亡,对Mtb的感染表现出天然的抗性。Ipr1基因抗Mtb的具体机制尚不清楚,因此了解Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb固有免疫和适应性免疫中的作用具有重要意义。　　1材料和方法　　1.1材料清洁级C57BL/6J小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。Clontech公司质粒载体pEGFPC1、大肠杆菌TOP10、小

8、鼠巨噬细胞株RAW264.7由本室保存。组织/细胞总RNA抽提试剂盒、RTPCR试剂盒（Ta