15脂氧合酶1在胃癌细胞ags中的表达

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1、15脂氧合酶1在胃癌细胞AGS中的表达作者：林芬，李建英，陈丰霖，陈治新，王小众【摘要】目的研究15脂氧合酶1(15LOX1)基因在人胃癌细胞AGS中的表达及其对AGS增殖凋亡的影响。方法通过脂质体介导瞬时转染15LOX1基因于培养的AGS中，逆转录PCR法和免疫印迹法检测15LOX1mRNA及蛋白表达；四甲基偶氮唑盐法（MTT）、流式细胞术、AnnexinV/PI染色与原位末端标记法（TUNEL）比较转染前后AGS的增殖和凋亡情况。结果胃癌细胞AGS转染后表达有15LOX1的mRNA及蛋白。与非转染

2、组及空质粒转染组相比较，转染重组质粒组AGS细胞生长明显受到抑制并且细胞周期停滞在G1期，其凋亡率明显高于非转染组及空质粒转染组。结论15LOX1基因能够抑制胃癌细胞AGS的增殖，并促进其凋亡。【关键词】花生四烯酸盐15脂氧合酶；胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；细胞增殖；细胞凋亡15脂氧合酶1(15lipoxygenase1,15LOX1)是脂氧合酶同工酶的一种，是机体催化花生四烯酸生成活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶，能够调节恶性肿瘤特别是上皮性肿瘤的存活。为了解15LOX1基因与胃癌的关系，本实

3、验采用体外细胞系基因转染法，研究15LOX141基因转染对胃癌细胞增殖及凋亡的影响，以探讨该基因与胃癌发生发展的关系及作为基因治疗的候选基因的可能性。1材料与方法1．1试剂重组15LOX1真核表达载体pcDNA3.1(+)/15LOX1由NIH的Eling博士惠赠，pcDNA3.1(+)表达载体由福建临床免疫研究所郑祥雄教授惠赠。质粒抽提试剂盒、逆转录试剂盒，脂质体转染试剂盒均购自美国Promega公司；RNA抽提试剂盒和AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自深圳生物晶美公司；山羊抗人15LOX1多克隆抗体购于

4、Santacruz公司（sc27354）。1.2方法1.2.1重组pcDNA3.1(+)/15LOX1质粒转染AGS细胞AGS细胞生长于含10%小牛血清的RPMI1640中，以脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1(+)/15LOX1、pcDNA3.1(+)质粒转入细胞中，命名为AGS／15LOX1、AGS／pcDNA3.1细胞。步骤如下：选取对数生长期细胞，消化接种于25cm×25cm培养瓶，细胞数为1×106L-1，待细胞贴壁，取无菌试管加入37℃预热的无血清培养基2mL，DNA5μg，TransFastRe

5、agent15μL，立即涡旋混匀，室温下静置10～1514min。小心吸出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体／DNA混合物，加入培养瓶中，37℃孵育1h，加入含血清的培养基4mL，37℃继续孵育48h。1.2.2逆转录PCR法（RTPCR）鉴定15LOX1基因在转染细胞中的表达分别抽提未转染AGS，AGS／pcDNA3.1,AGS／15LOX1三组细胞总RNA，取RNA样品2μg，42℃60min，99℃5min进行逆转录合成cDNA。15LOX1引物（485bp）上游：5'GCTGGAAGAGAGAAGGA

6、AGTTG3'下游：5'GAAGTCAGCTTCGAACAGTGTG3'内参βactin（776bp）上游：5'CTATTGGCAACGAGCGGTTC3'下游：5'CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3'取1μLcDNA进行PCR扩增（反应体系25μL）。扩增条件：94℃3min→94℃45s→57℃45s→72℃1min，25个循环；72℃147min。取8μLPCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶（含0.5g/L溴化乙锭）中电泳分离,紫外灯下观察结果。1.2.3免疫印迹法（WesternBlot）分析15

7、LOX1蛋白在转染细胞中的表达提取转染前后细胞总蛋白样品，Bradford比色法测定蛋白浓度。每孔25μg蛋白上样,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白印迹包括电转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗(1∶100)4℃过夜、二抗(1∶5000)室温轻摇60min,用化学发光试剂盒进行蛋白信号检测。设βactin作为内对照。1.2.4MTT法检测15LOX1对AGS细胞增殖的影响250mgMTT溶解于50mLPBS(0.01mol／LpH7.4)，过滤，4℃避光保存备用。将AGS细胞用含10%小牛血清的RPMI1640稀释成1

8、×104mL-1，接种于96孔培养板，分别于培养24，48，72，96h加入MTT20μL，继续培养4h，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，至结晶充分溶解，用酶标仪检测在波长490nm处吸光度D值，设只加培养液，不加细胞的空白对照孔调零，每组设8个复孔，取其均值。以时间(t)为横