sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)实验原理和操作步骤

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材：试剂：1.5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),

2、5ml50%甘油，2ml10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。3.pH8.9分离胶缓冲液：Tris36.3g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。4.pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7

3、，定容至100ml，4℃保存。5.TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7.pH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。8.考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋

4、5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。（二）分离胶及浓缩胶的制备1将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-RadMiniⅡ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；3按如下体积配制10％分离胶8.0ml，混匀；ddH2O3.0ml1.0mol/LTris-HClpH=8.82.1ml30%Acr-Bis2.8ml10%SDS80ul10%AP56ulTEMED6ul4向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约2

5、0min后胶即可聚合；5按如下体积配制6％浓缩胶3.0ml，混匀；ddH2O1.0mol/LTris-HClpH=6.830%Acr-Bis2.0ml400ul600ul10%SDS10%APTEMED36ul24ul4ul6将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20μl;8稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45min～1hr.9卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2hr；加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20min更换一次脱色液（10ml冰乙酸；45ml乙醇；45

6、ml蒸馏水）至完全脱净。