蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理、仪器试剂和操作步骤.docx

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1、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理、仪器试剂和操作步骤来源：易生物实验浏览次数：3230网友评论0条蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。关键词：电泳凝胶酰胺蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠原理]蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和

2、巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓

3、缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。[试剂]1、30%凝胶贮备液：称取29g丙烯酰胺（Acr）和1g甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。2、10%SDS：称取SDS10g加蒸馏水至100ml。3、10%过硫酸胺（AP）4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1gTris、94g甘氨酸、5gSDS，混匀后加蒸馏水至1000ml。6、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)和1.0mol

4、/LTris-HCl(pH6.8)7、电泳加样缓冲液10mmol/LpH6.8Tris200mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚兰20%甘油8.正丁醇[器材]1、移液器2、移液管3、烧杯4、垂直电泳槽5、电泳仪[操作步骤]1.配制分离胶浓度8%、体积15mlH2O6.9ml30%凝胶贮备液4.0ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)3.8ml10%SDS0.15ml10%过硫酸胺0.15mlTEMED0.01ml2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙

5、中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。3.聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。4.配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。H2O3.4ml30%凝胶贮备液0.83ml1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8)0.63ml10%SDS0.05ml10%过硫酸胺0.05mlTEMED0.01ml5.在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3mi

6、n。6.成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。7.加样8.电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。9.取下凝胶，固定、染色或进行Westernblot分析。