资源描述：
《特定基因表达水平的检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-1023:19:59来源：易生物实验浏览次数：192网友评论0条Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。关键词：
2、基因表达RNA-gelblotanalysis或NorthernBlot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位
3、转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但
4、更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。一、试剂准备（易生物试剂购销平台www.ebioe.com/yp/product-list-43.html）1、0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,调pH至8.0,定容至100ml。2、50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振荡,37℃过夜，高压灭菌。3、5×甲醛凝胶电泳缓冲液:MOPS[3-(N-玛琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH调pH至
5、7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。4、20×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。5、6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。6、50×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,无菌抽滤、分装。7、1MNa
6、2HPO4:Na2HPO4•12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。8、1MNaH2PO4:NaH2PO4•2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。9、0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。10、STE缓冲液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。11、预杂交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml
7、（pH6.6）,10%SDS1ml,总体积20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。12、DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。二、操作步骤1、总RNA提取：见相关内容。2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPCH2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。3、样品制备：取总RNA4.5μ
8、l(约20-30μg)，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-1023:19:59来源：
