总结-酵母酶活测定

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1、2.9.3β-Galactosidase酶活定量实验参考ClontechYeastProtocolsHandbook进行。酵母酶活测定，准备：每个样品，8ml的YPD培养基，Y190菌株（转化用）。Zbuffer，Zbuffer+beta-巯基乙醇，Zbuffer+ONPG，NA2CO31)准备5mlSD/-Leu/-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌，同时将ONPG溶解在Z缓冲液中（4mg/ml，调pH7.0）并振荡混匀1-2hr；2)旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1min，立刻取出2ml加入8ml的YPDA中；3)30℃250rpm摇3-5hr，测OD

2、600在0.5-0.8之间并记录确切OD值；4)取3个1.5ml的EP分别倒入1.5ml菌液，14,000rpm离心30sec，小心弃上清，加入1.5mlZ缓冲液，振荡以重悬菌体；5)离心去上清，加入300μlZ缓冲液重悬菌体（则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍）；6)取0.1ml至新管中，液氮冷冻0.5-1min，37℃0.5-1min使其融化；7)反复冻融3次以上使细胞尽可能破碎；8)取一个新管加入100μlZ缓冲液作为空白对照；9)每管中加入0.7mlZ缓冲液+β-巯基乙醇，加入160μl溶在Z缓冲液中的ONPG同时开始计时，将管置于30℃温浴；10)当

3、溶液变为黄色时，加入0.4mlNa2CO3中止反应，计录反应时间t；11)14,000rpm离心10min，取上清，测OD420值；12)计算β-Galactosidase酶活：β-Galactosidaseunits=1,000×OD420（t×V×OD600）t为反应时间（第10步记录）V为0.1×浓缩倍数（第5步记录）OD600为第3步所测OD值2.9.4提取酵母蛋白参考ClontechYeastProtocolsHandbook进行。1)接酵母菌于SD/-Leu/-Trp培养基中，30℃摇培过夜；2)扩培至50mlYPDA培养基中，30℃摇培至OD6

4、00为0.4-0.6，计算总OD600值：测得的OD600值×培养液体积；3)将菌倒入预冷的离心管中，4℃1000×g5min，弃上清，细胞重悬于50ml预冷的超纯水中；4)4℃1000×g5min，弃上清，冷的超纯水再洗一次，沉淀冻到液氮中，继续下面的实验或冻存于-80℃；5)每7.5OD600加入100μl60℃预热的裂解缓冲液（用前加入PMSF和cocktail，因PMSF有半衰期，需每隔7min补一次），60℃水浴小于2min使菌体融化并重悬起来；6)转移到1.5ml的EP管中，加入适量glassbeads（80μl/7.5OD600），70℃10m

5、in，剧烈振荡1min；7)4℃14,000rpm离心5min，将上清转移至新的EP管中并置于冰上；8)沉淀置于100℃3-5min，剧烈振荡1min，4℃14,000rpm离心5min，小心吸取上清，并将两次的上清合到一起；9)100℃10min煮样，即可进行westernblot。试剂配置YPDA培养基：1L配方：20gDifopeptone，10gYeastextract，15ml0.2%adeninehemisulfatesolution，加水至950ml，灭菌后冷却至55℃再加入50ml40%的葡萄糖（葡萄糖溶液可112℃灭菌或抽滤灭菌），若为固体

6、培养基灭菌前还需加20g/LAgar；SD/-Leu/-Trp培养基：6.7g/LYeastnitrogenwithoutaminoacids，0.67g/L-Leu/-TrpDOsupplement，若为固体培养基需加20g/LAgar，灭菌；SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基：6.7g/LYeastnitrogenwithoutaminoacids，0.6g/L-Ade/-His/-Leu/-TrpDOsupplement，若为固体培养基需加20g/LAgar，灭菌；贮存液：10×TE：0.1MTris-HCl，10mMEDTA，调pH7

7、.5灭菌，10×LiAc：1MLiAc，乙酸调pH7.5灭菌，50%PEG4000；PEG/LiAc：40%PEG，1×TE，1×LiAc；Z缓冲液：16.1g/LNa2HPO4·7H2O，5.5g/LNaH2PO4·H2O，0.75g/LKCl，0.246g/LMgSO4·7H2O，调pH7.0并灭菌；Z缓冲液+β-巯基乙醇：100mlZ缓冲液加入0.27mlβ-巯基乙醇；裂解缓冲液：储存液：8M尿素，5%SDS，40mMTris-HCl（pH6.8），0.1mMEDTA，0.4mg/ml溴酚兰，使用前每毫升储存液加入10μlβ-巯基乙醇，并加蛋白酶抑制剂

8、PMSF和cocktail。2.10酵母互补实验所用